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(無題) 削除/引用 No.10315-6 - 2022/03/04 (金) 12:18:50 - ななしのひと シーケンスが読めないほど壊れているのだとしたら、薬剤耐性遺伝子が機能しているのが不自然だと思います。 セレクション培地の抗生剤が失活していて、空コロニーが増えている、そして空コロニーを抽出しているような気がします。 この場合、取れているDNAはプラスミドではなく、大腸菌の内在性ゲノムなどを抽出してしまっているのかもしれません。 培地を改める、抽出方法を改める、コントロールプラスミドを置くなどはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10315-5 - 2022/03/04 (金) 09:50:00 - G25 精製したプラスミドのシークエンスが読めないというのも問題でしたね。 プライマーが有効でないとかでもなければ、プラスミドのシークエンスだもの、楽勝のはずですものね。 制限酵素消化のパターンはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.10315-4 - 2022/03/04 (金) 09:32:43 - s Addgeneは普通に常温でDNA溶液として送ってきますね。壊れてたことはないです。

(無題) 削除/引用 No.10315-3 - 2022/03/04 (金) 06:44:17 - 774 ＞そこでクローニングする前のmidiprepしたものをシークエンスすると配列が読めないことが続いています。 transformまでは出来るようですので、プラスミド精製がうまくいってないか、やっぱりプラスミドが違うという可能性があると思います。 違う方法・キットで精製して確認する。 大元のプラスミドの配列を読む。 プラスミドを区別できる領域をPCRで増やしてシークエンス。 かなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10315-2 - 2022/03/04 (金) 00:42:52 - G25 > ほとんどはpcDNA3.1ベースのempty plasmidsですが、これらをコンピに形質転換後、amp入りLBアガープレートに撒きました。 >コロニーはたくさんでて、miniprep、midiprepまでいけるのですが、 だったらプラスミドが壊れているなんて言いがかりでしょう。 合理的に考えましょうよ。 > それらを使ってクローニングしようとすると全くコロニーが生えません。 入れたDNA断片が悪さをしてコロニーが出ないということはありがちです。 コードされているタンパク質がleakyな発現をして、それが宿主に毒性を持つ場合など。 クローニングしようとしているものは、そういう可能性あるんじゃないですか？ 毒性によってコロニーが生えてこない場合の手立てについては過去トピに何度か出ている。 「コロニーが全く生えない」と言うのが非組換体も出てこないと言うなら別の問題もあるかもしれないけど。例えば、ゲル精製の時のUV被曝によるピリミジンダイマー形成でダメになってるとか。 クローニングの手順について詳しく書いたら、問題点が見えてくるかも。

海外からのプラスミドが壊れている？ 削除/引用 No.10315-1 - 2022/03/03 (木) 23:47:11 - プラスミド ご相談したいことがありまして、トピックを立てさせていただきました。 海外からプラスミドを送ってもらいました。 miniprepしたものを液体のまま、1.5 mlチューブに数マイクロL入ったものが室温で送られてきました。 ほとんどはpcDNA3.1ベースのempty plasmidsですが、これらをコンピに形質転換後、amp入りLBアガープレートに撒きました。 コロニーはたくさんでて、miniprep、midiprepまでいけるのですが、それらを使ってクローニングしようとすると全くコロニーが生えません。そのためモノが取れません。 そこでクローニングする前のmidiprepしたものをシークエンスすると配列が読めないことが続いています。 miniprep　（P1, P2, P3の後にエタ沈後にTEに溶解したもの）産物を室温で数日かけてアメリカから日本へ運搬中に壊れてしまったのでしょうか？ プラスミドは私がアメリカから梱包し、それを送ってもらったモノなので、モノが間違っている可能性はありません。 プラスミドは結構壊れやすいのでしょうか？ やはり濾紙にプラスミドを落とし、充分乾燥させたのちに、室温で郵送するのが第一選択なのでしょうか？ 時間と気力を奪われてしまい、自己解決出来ずここで質問させていただければと思い、トピックを立てました。 どうか、御助言いただけますと幸いです。

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