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(無題) 削除/引用 No.10319-6 - 2022/03/11 (金) 17:31:51 - BCC プロテオミクスの特集号を見ても載っていないのですが、ラダー状のタンパク質が一括で網羅的に同定できるということでしょうか。もちろんどのバンドが、どのタンパク質なのかの特定は容易ではないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10319-5 - 2022/03/11 (金) 01:25:12 - おお >1-2cmのゲルで全体のタンパク質を提出するのもありだと言われました。 よくある方法です。

(無題) 削除/引用 No.10319-4 - 2022/03/10 (木) 23:35:35 - BCC コメントありがとうございます。 大学内にあるプロテオミクスコアに相談しました。 スタッフによると、ゲルの面積あたりのタンパク質の濃度が重要なので、長い時間泳動して1個1個切り出してもいいが、ミニゲルで短時間泳動して、1-2cmのゲルで全体のタンパク質を提出するのもありだと言われました。これで全体のタンパク質のプロファイルが得られるというのは、少し信じがたいのですが、正攻法なのでしょうか。少し慎重になっています。 また、銀染した後のゲルって4Cである程度の期間保存できますか？タンパク質は壊れないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10319-3 - 2022/03/07 (月) 10:18:55 - asan 目的と具体的なアプローチによるんですけど、バンドの差異を目視で判断するのは限界がありますよ。CBBか銀染色かわかりませんがCBBだと見えるバンドは限られますし泳動のズレもあります。目視で差が見えてるバンド＝1つのプロテイン由来かどうかはわかりませんから。 DDA（一般的なショットガンプロてオミクス）で新規タンパク質を探索に行く場合は、ゲルで泳動分画した場合でも全面切り出してlaneごと測定するのは最近では一般的です。目的はサンプルの複雑性を減らすことなんで、検出力が落ちてもいいならin solutionで直接酸溶出してそのまま1 runで解析することもあります。この場合は抗体が溶出してこないようにbeadsに固定して酸溶出とかしますけど、サンプルの状態がわからないのでいきなり質量分析にかけるのを嫌がられますね。 いずれにせよ、測定予定の共同研究先か業者に実験のおおまかなスキームを持って行って最適な方法を相談したほうがいいです。測定者の経験とかその後のデータ処理の仕方で好き嫌いもありますしね。

(無題) 削除/引用 No.10319-2 - 2022/03/05 (土) 23:15:43 - えrtyふ 培養細胞ならSILAC法が普及しているのですから、電気泳動せずに、コントロールIPサンプルとテスト検体IPサンプルそのまま等量混ぜて解析に送ればいいと思います（この辺りの具体的な細かいことは実験計画含めてMSの解析の委託先とあらかじめよく打ち合わせしてください。）。バックグラウンドのコンタミか本物の相互作用タンパク質かはMSで識別できますから基本的には非特異的な夾雑タンパク質が結構あっても構いません。

新規結合タンパク質の同定のために、Co-IPをしました。 削除/引用 No.10319-1 - 2022/03/05 (土) 16:38:26 - BCC 新規結合タンパク質の同定のために、Co-IPをしました。Inputを1レーン目に、Isotype antibody controlのbeadsのelutionを2レーン目に、Target antibodyのbeadsのelutionを3レーン目に流して比較を行いました。 現在バンドの比較を行っていて、どのバンドをMassで解析したらいいのか、迷っています。以下現在の状況を書きます。アドバイスをいただけないでしょうか。 A. Targetのタンパク質はおそらく見えていて、3レーン目に濃く見られます。 B. 3レーン目だけに見えているバンドがわずかですが見られます。 C. Controlとtargetでほぼ同じ量のタンパク質を使用していますが、概して2レーン目は濃度が薄い印象を受けます。1レーン目と2レーン目と3レーン目のバンドは結構多く共通しているように見えます。 D. その一方で2レーン目にないけれども1レーン目と3レーン目に共通しているように見えるバンドもあり、これを候補に含めていいのか悩みます。濃縮していないともいえる気がしますし、また同じ位置にあるだけで、違うバンドの可能性も否定できませんが。 つらつらと事実だけを書きましたが、アドバイスをいただけないでしょうか。比較的多くのバンドが見えていると分画だけ取り出して、やり直した方がいい気もしてきましたが、過去の文献も結構なバンドを提示しているので、やり直した方がいいのかまだ悩んでいます。

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