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sgRNA のコンストラクト作製に関する疑問 トピック削除
No.10325-TOPIC - 2022/03/09 (水) 15:20:30 - クリスプ君
はじめまして。
CRIPSR/Cas を使った遺伝子操作の論文を読み、関心をもった者です。所属ラボではこの手の技術をまったく触っておらず、興味のある疑問を解消する場がなくこちらにたどり着きました。CRISPRaやiを行う際に sgRNA の設計について書籍を読んでいてよくわからなくなったので教えていただければと思います。

要約すると
１．sgRNA のプラスミドには検索でヒットしたcrRNAに相補的な塩基を入れる？
２．U6 promoter と sgRNA の間の塩基配列に G(グアニン)が入っても大丈夫？
という疑問です。

例えば、chopchop や CRISPR direct を用いて標的遺伝子のプロモータ配列を検索したとき、特異性の高そうなガイド（crRNA）の第一候補がセンス鎖上の配列であったとします。これをU6プロモーター下で転写させようと思った場合、プラスミドには当該配列に相補的な塩基を組み込めばよい、ということであっているのでしょうか？

例えば、下記がガイドとしてトップに挙がってきた場合（※配列は適当です）
　　　　 5'-gactgctagaggctccgatt-3'
相補的な配列である 5'-ctgacgatctccgaggctaa-3' を U6 promoter と tracrRNA にそれぞれつなぎ、TTTT で polIII の反応を止めるようなコンストラクトをつくればよいのでしょうか。

U6-ctgacgatctccgaggctaa-tracrRNA-TTTT

U6 promoter 下での転写開始には G が必要との情報もありますので

U6-(g)ctgacgatctccgaggctaa-tracrRNA-TTTT

加えて、U6 とガイドの間に制限酵素サイトを含む塩基配列がある場合もありますが、この塩基配列に G が含まれる場合、tracrRNA は正しく転写されるのだろうか（望んだ設計のものより長くならないのか）など気になりました。

本読みだけでは理解に限界があり、皆様には初歩の初歩かと思いますが、コメントいただけますと幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.10325-3 - 2022/03/10 (木) 03:19:48 - クリスプ君
＞AAさま
ありがとうございます！
リンク先を拝見しました。これなら、U6の直下で転写がはじまることになりますね。一方、crRNAと赤で示されたtracrRNAの間に塩基配列が挟まって見えるのですが、これは問題ないのでしょうか。

実施例をみていると、U6 の直下に10塩基くらいの配列（G を含む）を挟んで crRNA が続いているものも見受けられますが、問題ないのかがやはり気になります。実際にコンストラクトのトランスフェクションを行って、sgRNA が狙った長さで転写されているか配列を読む必要があるんでしょうか。


あと、私の質問文をよくよく読み返してみると、センス鎖の配列がcrRNA候補にあがってきた場合は U6 直下にそのままセンス鎖の配列を組み込めばよいですね、鋳型鎖を使って5'→3'方向に転写されるわけだから。なんだか混乱してしまいました。

(無題) 削除/引用
No.10325-2 - 2022/03/09 (水) 18:07:01 - AA
ttps://www.addgene.org/crispr/zhang/

Addgeneに掲載されている情報です。
例えば制限酵素についてはBbsIなどの認識配列から離れた部位を切断する物を背中合わせにつないだものが使われサイトが残らないようになっています。

sgRNA のコンストラクト作製に関する疑問 削除/引用
No.10325-1 - 2022/03/09 (水) 15:20:30 - クリスプ君
はじめまして。
CRIPSR/Cas を使った遺伝子操作の論文を読み、関心をもった者です。所属ラボではこの手の技術をまったく触っておらず、興味のある疑問を解消する場がなくこちらにたどり着きました。CRISPRaやiを行う際に sgRNA の設計について書籍を読んでいてよくわからなくなったので教えていただければと思います。

要約すると
１．sgRNA のプラスミドには検索でヒットしたcrRNAに相補的な塩基を入れる？
２．U6 promoter と sgRNA の間の塩基配列に G(グアニン)が入っても大丈夫？
という疑問です。

例えば、chopchop や CRISPR direct を用いて標的遺伝子のプロモータ配列を検索したとき、特異性の高そうなガイド（crRNA）の第一候補がセンス鎖上の配列であったとします。これをU6プロモーター下で転写させようと思った場合、プラスミドには当該配列に相補的な塩基を組み込めばよい、ということであっているのでしょうか？

例えば、下記がガイドとしてトップに挙がってきた場合（※配列は適当です）
　　　　 5'-gactgctagaggctccgatt-3'
相補的な配列である 5'-ctgacgatctccgaggctaa-3' を U6 promoter と tracrRNA にそれぞれつなぎ、TTTT で polIII の反応を止めるようなコンストラクトをつくればよいのでしょうか。

U6-ctgacgatctccgaggctaa-tracrRNA-TTTT

U6 promoter 下での転写開始には G が必要との情報もありますので

U6-(g)ctgacgatctccgaggctaa-tracrRNA-TTTT

加えて、U6 とガイドの間に制限酵素サイトを含む塩基配列がある場合もありますが、この塩基配列に G が含まれる場合、tracrRNA は正しく転写されるのだろうか（望んだ設計のものより長くならないのか）など気になりました。

本読みだけでは理解に限界があり、皆様には初歩の初歩かと思いますが、コメントいただけますと幸いです。
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