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pTEプラスミドの高濃度調製 トピック削除
No.10333-TOPIC - 2022/03/11 (金) 11:01:31 - 地方学生
地方大学で研究を行っているもの(学生)です。
初歩的な質問かもしれませんが、ローコピープラスミドであるpETプラスミドを高濃度調製するための具体的な方法をご教授ください。よろしくお願いいたします。
 
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No.10333-9 - 2022/03/14 (月) 07:43:45 - 前世紀
ちょっと話題が逸れますが、プラスミドの調整にキットを使う方ってそんなに多いのですか。もちろんトランスフェクションに使うとかならわかるのですが、プラスミドの構築やシークエンスにはエタノール沈殿程度で十分だと思うんですけど。カラムのチューブに差し込む部分に触れないようにチマチマ差し込んだりするのってかえって面倒じゃありませんか。

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No.10333-8 - 2022/03/13 (日) 10:56:19 - G25
大昔はpBR系にはクロラムフェニコールを使っていましたが、手間の割に効果が薄いので、とうにやめました。量がほしければ培養のスケールアップで対応するし、そもそもいろいろな手法の効率が向上して、少量、微量で十分できるようになってきているので、量が沢山必要ということもあまりなくなりました(例えば昔はシークエンスの確認するにもugオーダーのプラスミドが必要だったので、pBR系だと通常のミニプレップでは全然足りなかった)。

pUC系が500-1000 copy/cellなのに対し、pBR系は30 copy/cellくらいといいます。おおよそ1/20以下ですね。実際、mini prepでpUC系なら5 ugくらい取れるところpBRなら100 ngくらいなのでそんなもんでしょう。
何れにせよ、クロラムフェニコール使っても数倍にしかならないので、pUC系に追いつくほどじゃない。だったら培養スケールを上げたほうが満足な量が得られます。

いまでは多くの人が、プラスミド精製をキット頼りでやっていると思いますが、それがスケールアップを躊躇させるのかもしれません。スケールアップすると多少のオーバーロード覚悟でやるか、キットのサイズを大きくするとかしないといけないですから。
私はそういうとき、キットを使わないアルカリ/SDS法でやるので、スケール変更がフレキシブルです。いわゆるsoln 3のあとアルコール沈殿で回収します。これでコンストラクト構築など大抵の用途には十分です。もっと精製が必要ならPCI抽出をかますか、アルコール沈殿で回収したプラスミドを市販の精製キット(フラグメント精製用あるいはミニプレップ用)にかけます。粗精製後ですから、培養スケールを大きくして始めても、キットのサイズは普通のでいけます。

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No.10333-6 - 2022/03/12 (土) 23:21:04 - 地方学生
nonameさん、地方教員さん、sさん、あかねさん
貴重な意見ありがとうございます。ぜひ、ご提案された方法を試してみたいと思います。

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No.10333-5 - 2022/03/12 (土) 16:37:25 - あかね
すごいタイミングですが、まったく同じ悩みを抱えていて、先週解決したのでお伝えします。
なんなら、私もこの掲示板にポストしようかと思っていました。

培地組成や、培養時間、大腸菌株など色々と試しましたが、結果的にはnonameさんが紹介くださっているクロラムフェニコールが断然オススメです。DNAの収量は4倍程度に上がります。

我々の場合はミニプレップするpETプラスミドの収量が低くて頭を抱えていたのですが、以下のようにして収量を挙げました。
コロニーを9:00AMにピックアップし、2mL 37°C培養 (抗生物質アリ)。
夕方17時にクロラムフェニコールを添加し、O/N.

朝からコロニーをピックアップするのは抵抗ありましたが、増殖曲線中にクロラムフェニコールを添加するというのはミニプレップの場合では、この方法しかないかと。

Good Luck!!

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No.10333-4 - 2022/03/12 (土) 11:29:41 - s
どの程度コピー数が少ないかにもよるけど、スケールアップしただけだと大腸菌ゲノムのコンタミが無視できなくなって収拾がつかなくなることがあります。

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No.10333-3 - 2022/03/12 (土) 10:58:55 - 地方教員
nonameさんが示されているようにクロラムフェニコールでamplifyする手もあるけど、単に培養をスケールアップするんじゃだめなの?

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No.10333-2 - 2022/03/11 (金) 11:23:45 - noname
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&ved=2ahUKEwiJj4Xm_7z2AhVwyIsBHVWHAfoQFnoECCwQAQ&url=https%3A%2F%2Fwww.sbj.or.jp%2Fwp-content%2Fuploads%2Ffile%2Fsbj%2F8910%2F8910_yomoyama-2.pdf&usg=AOvVaw0W7ISnzx2WSVjvzsavlQ5j

pTEプラスミドの高濃度調製 削除/引用
No.10333-1 - 2022/03/11 (金) 11:01:31 - 地方学生
地方大学で研究を行っているもの(学生)です。
初歩的な質問かもしれませんが、ローコピープラスミドであるpETプラスミドを高濃度調製するための具体的な方法をご教授ください。よろしくお願いいたします。

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