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(無題) 削除/引用 No.10341-11 - 2022/03/18 (金) 07:59:24 - ず 水で脱色するときレンチンすると時短できて便利ですね

(無題) 削除/引用 No.10341-10 - 2022/03/18 (金) 03:17:20 - おお 脱色は私も水でやってます。 コツとまで行きませんが以下のことを心がけています。 染色は短めにする。１０分程度でいいのではないかと思っています。タンパクはCBBに吸着する性質を持っているのでCBBが完全にゲルに浸透するまえに染色が進んでいると思います。 染色液を除いた直後は酢酸、アルコールを含む脱色液で一度軽くでいいからすすいでおく。そして水に入れ替える。 水に入れ替えたあとは、キムワイプかペーパータオルをちぎったものを入れておく（紙がCBBを吸着してくれるので水は脱色が進んでも水はCBBを含まない）。 これで多少は早くなります。 あと有機溶媒系はケミカルフードないでやるとか、密閉できるタッパーにいれて（直接でもゲルの入った容器でも）おくようにする。開けるときはケミカルフード内でやるなど心がけたほうがいいと思います。 酢酸などを使わない方法はコロイダルCBBだと思います高感度な方法として注目された方法です。

(無題) 削除/引用 No.10341-9 - 2022/03/17 (木) 15:26:00 - 素人質問 オーバーナイトで水での脱色をしてみましたが、朝見たらばっちりと脱色できていました。 今まで通りの方法で脱色していた時より時間はかかりますが、脱色の度合いは遜色有りません。 「参考までに」さんの紹介してくれた論文でもそうでしたが、脱色液を水にしてみようと思います。 これでラボの「におい問題」解決です！。 大変参考になりました。ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.10341-8 - 2022/03/17 (木) 15:11:17 - 参考までに 有機溶剤を用いないプロトコールです。 PMID 19684570

(無題) 削除/引用 No.10341-7 - 2022/03/17 (木) 15:03:24 - G25 CBB染色液中のアルコールはCBBを溶かすためだけでなく、タンパク質との疎水結合力を高めて、静電相互作用とは別に染色性をたかめる役割もあるようです。 廃液処理が面倒でしばらく前から脱色は水でやっていたのですが、 脱色が水でOKの市販品だったかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10341-6 - 2022/03/16 (水) 19:20:59 - 素人質問 今日、CBB染色をする予定だったので、余っているウェルにサンプルを流して、酢酸で脱色するものと、水で脱色するものの2つを試してみました。 10％ 酢酸では脱色しますが、水では全く脱色しないか、非常に脱色が遅いです。

(無題) 削除/引用 No.10341-5 - 2022/03/16 (水) 14:02:08 - 素人質問 なるほど。 疎水性のCBBを可溶化するための有機溶剤としてのイソプロパノール、メタノール。 タンパク質のアミノ基を正に荷電させ、CBBのスルホニル基の負電荷を保つ酢酸。 それに加え、タンパク質を変性して固定させたりSDSを除去する役割も。 非常に合理的な説明で感動しました。 臭いの無いCBBの処方があるとの情報、ありがとうございます！ 早速調べてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10341-4 - 2022/03/16 (水) 01:28:04 - b cbbはいろんな処方があって、ほとんど匂いのないcbb染色液も売ってるよ。酢酸の代わりにクエン酸とかりん酸つかい硫安も入れる処方（常法より1.5倍くらい高感度で長時間の染色でもバックがかなり低い、水で脱色可能、染色に数時間かかるのが難点）もある。CBBもG250のものと R２５０のものとがある。LC-MS?MSのプロテオミクス の分析の際に稀に起こる非酵素的アセチル化の問題を避けるため醋酸使わない処方は最近割とよく見る。

(無題) 削除/引用 No.10341-3 - 2022/03/16 (水) 00:14:34 - おお G25さんの言う通り酢酸は電荷による相互作用を強化する役割があるとおもいます。昔はTCAというもっと強い酸を使うプロトコールもまあまあ使われていたと思います。 加えてアルコールと酢酸はタンパク固定の役割があると思います。変性させることにより部分的に沈殿したような状態とか、ゲルと相互作用するとか。可溶化剤のSDSなども効率的に除くことができるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10341-2 - 2022/03/15 (火) 16:29:24 - G25 単純な話で、CBBは水にほぼ不溶なので、アルコールを加えているのです。 従来、PrOHではなくてMeOHを使うもの。 なぜPrOHを使うのかの答えは、MeOHが毒劇物（法令上の区分は劇物）、取り扱いや保管、廃棄処理のためになるべく使わないようになってきているから、安全なものに置き換えるため。 MeOHに比べたらPrOHの毒性なんてないようなもの。EtOHにしないのは、EtOHがMeOHやPrOHに比べるとずば抜けて高価だからでしょう。 酢酸をいれるのは、私の理解では次の通り。 CBBの青色が中庸な酸性で発色が良いことがひとつ。 もう一つは酢酸がもたらすくらいの低いpHがタンパク質のアミノ基をよく電離させ正電荷を強める一方、電離度の高いCBBのスルホン酸基の電離は抑制させることなく負電荷を帯びたままなので、静電気力でCBBがタンパク質によく結合するようになるから。 なおCBB染色に関しては、メタノールあるいは酢酸を不使用あるいは減量した、私家版プロトコールやメーカー製品がいろいろ出ているようです。染色結果が満足いくかどうかはそれぞれですが。 少なくとも、染色はともかく、脱色液はメタノール/酢酸を使わないで蒸留水でも、十分かなと思います。

CBB染色について 削除/引用 No.10341-1 - 2022/03/15 (火) 14:09:06 - 素人質問 いつも参考にさせてもらっています。 CBB染色をやっていて気になったのですが、CBB染色にはCBBと酢酸とイソプロパノールの混合液を用いています。 有害なイソプロパノールと、刺激臭を放つ酢酸で、いつもラボに迷惑をかけているような気がします。 ところで、酢酸とイソプロパノールは何のために入っているのでしょうか？ ふとした疑問なのですが、気になって調べてみても見つかりませんでした。 ご存じの方がいらっしゃいましたら、ご教授願います。

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