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レンチウイルスのタイターが低い トピック削除
No.10345-TOPIC - 2022/03/16 (水) 16:33:50 - スーパーレンチ
レンチウイルスの作製について困っております。
下記の流れでレンチウイルスを作製しましたが、希望通りのタイターのウイルスが得られません。タイターを上げるために何かよい工夫はありますでしょうか？

・293T細胞にトランスフェクション（効率90%）
・15cm dish 2枚あたり培地量が34ml（これが15cm 8枚）
・これらを50ml tube 1本に2 dish分回収して遠心（12000g 5min）。
・上清をデカンテーション でフィルター
・4×PEG 12mlを50mL tubeに入れて、ろ過したウイルス液34ml程度を入れる。
・4度でover night
・遠心（遠心機のメモリー2 1750G ）、上清を捨てる。
・1000ulで再懸濁

培地や血清など高くついてしまいますので、タイター上がらないとコストがかかって仕方ないです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.10345-5 - 2022/03/20 (日) 12:00:30 - TOKIO
あ、PEI maxはコスト削減のためなので、お金があるようでしたらLipofectAmineの方が入ると思います。
ただ、PEI maxだとコストをほぼ無視できるので。。

(無題) 削除/引用
No.10345-4 - 2022/03/20 (日) 11:56:59 - TOKIO
transfectionをPEI maxでやる。
packaging plasmidsを第三世代ではなく第二世代(psPAX2, pMD2G)でやる。
あたりが解決方法でしょうか。
ベクターのインサートが大きいとタイターは上がりにくいです。

(無題) 削除/引用
No.10345-3 - 2022/03/16 (水) 17:48:01 - asan

あと12000gで5分はまあ問題ないとは思うけど、若干強すぎると思うのでフィルター前にデブリスを除くだけなら3000gで1-2分程度にしたほうがいいでしょ。いくら超遠心じゃないと落ちないといっても、6000gで15時間とかいうプロトコールがあるように、あまり高速で遠心かけるとウイルスも沈殿する可能性はありますよ。

(無題) 削除/引用
No.10345-2 - 2022/03/16 (水) 17:43:52 - asan

そもそも原因がどこにあるのかによるのでね。
ウイルス自体の産生量が少ないなら、一般的にはパッケージ細胞の状態が良くないとかだと思うので新しく起こし直す必要があると思います。GFPなどの一般的なもので調子が悪いなら、新しい元気な細胞をどっかでもらってくるか、LTVなどのパッケージ効率が良いものを入手するしかない。

特定のウイルスベクターだけで産生効率が悪いなら、まずはベクターにへんなものがコンタミしてないかを電気泳動をしたりして確認してみるのがいい。パッケージング用のベクターがおかしくなってることもあるのでそれも含めて。

いずれの場合もウイルス産生に問題があるという前提になってるけど、多くの場合問題になるのは感染する細胞自体であることが多い。293Tなどでtiterが十分ある状態のウイルスで感染効率が悪いならその細胞の問題なので、ウイルスを単純に増やすか、レトロネクちんなどを試すか、spinfectionとか色々試すしかない。

プロトコールを見た感じPEG6000?あたりで沈殿させるのに4度でO/Nって普通はしないと思うけど、このプロトコールは過去にうまくいってるんですか？プロトコールが不安ならば、走らせるついでに濃縮しない状態のものを293Tあたりに感染させて濃縮プロセスでロスってる（失活してる）可能性を含めてきちんとトラブルシュートするしかない。

レンチウイルスのタイターが低い 削除/引用
No.10345-1 - 2022/03/16 (水) 16:33:50 - スーパーレンチ
レンチウイルスの作製について困っております。
下記の流れでレンチウイルスを作製しましたが、希望通りのタイターのウイルスが得られません。タイターを上げるために何かよい工夫はありますでしょうか？

・293T細胞にトランスフェクション（効率90%）
・15cm dish 2枚あたり培地量が34ml（これが15cm 8枚）
・これらを50ml tube 1本に2 dish分回収して遠心（12000g 5min）。
・上清をデカンテーション でフィルター
・4×PEG 12mlを50mL tubeに入れて、ろ過したウイルス液34ml程度を入れる。
・4度でover night
・遠心（遠心機のメモリー2 1750G ）、上清を捨てる。
・1000ulで再懸濁

培地や血清など高くついてしまいますので、タイター上がらないとコストがかかって仕方ないです。
よろしくお願いいたします。
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