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(無題) 削除/引用 No.10356-27 - 2022/04/08 (金) 23:18:37 - b ECLの反応は、ラップに数滴垂らして（幕のサイズによる）その上にメンブレンを、転写面を下（伏せるようにして）にして置き（こうすることで均一に行き渡らせます）1〜2minくらい静置します。そのあとピンセットでメンブレンをつまみ上げてさっと数回軽く振ってから、クリアホルダー（バインダーとかに入れるすごい薄いやつ）を切ったのの中に入れて上からキムタオルを置いてあまり力入れずに手で平らにします。余分な液体はこの時に幕の周りに薄く広がっていきます。 メンブレンが乾かないように手早くクリアホルダーに密封するのがポイントです。半乾きになるとバックが汚くなることがあります。

(無題) 削除/引用 No.10356-26 - 2022/04/08 (金) 02:35:17 - iiii ミリポアのImmobilonを使っていますが、あまり評判がよくないのでしょうか。Am社とサンプルをもらったBi社を使ってシグナルが全くでず、ミリポアできれいに出て失敗もないのでずっとこれにするつもりでいます。 メンブレンを発光試薬に1分間反応させて余分な試薬を落とし、湿っている状態で機械のガラスの上にのせて、その上に透明なフィルムでカバーして、機械の蓋を閉じてスキャンします。フィルムの場合はカセッテに透明なフィルムを入れてその上に湿ったメンブレンをのせて、また透明なフィルムでカバーして（サンドイッチ状にする）暗室に行き、フィルムをセットして露光と現像です。透明なフィルムはOHP（若い人は知らないかも？）のフィルムを使います。たまにザラザラした透明フィルムがありますが、それですとうまくいきません。クリアーなフィルムを使います。

(無題) 削除/引用 No.10356-25 - 2022/04/07 (木) 17:32:59 - G25 >透明なフィルムに挟んでます。 100均で売っているカードや写真を保存する透明袋がいいです。 １辺を残して折返しは切り開いて。 ぺらぺらで安っぽいのがよいです。厚手だと折れぐせ、曲がりぐせで一部浮き上がって密着しないことがある。薄手だとシワが付いていいようと濡れると密着します。 ある撮像装置の技術さんオススメの方法。

(無題) 削除/引用 No.10356-24 - 2022/04/07 (木) 17:06:51 - おお 透明なフィルムに挟んでます。 撮影時間が長くなると乾かないか心配なので。拭き取ると言うわけではないですがフィルムにはさまれているので拭き取ったのと近い状況だと思います。挟んだあと簡単にしごいたりしますので。 ＞反応液で湿られたろ紙の上にメンブレンを乗せて検出したりする。 これそういう話聞いてやってみたんですがX-ray filmぐらいしかない時代に、バックが結構上がったのでだめだなぁと思った記憶が、、、 膜だけ完全な反応液につけて、ろ紙はルミノール（かそれに変わるもの）だけにすると改善するとかあるかな、、、

(無題) 削除/引用 No.10356-23 - 2022/04/07 (木) 16:42:12 - G25 発光反応液がだぶついているとシグナルがにじみやすい。 過剰の液のなかだとperoxidaseの反応産物（酸素）が遠くまで拡散するのでバンド以外のところが曇る。シグナルが強くて反応が強く速いときは顕著に曇る。 慎重な人は、反応液で湿られたろ紙の上にメンブレンを乗せて検出したりする。 メンブレンの上に液が残っていると、クエンチや屈折でムラになる恐れもある。

(無題) 削除/引用 No.10356-20 - 2022/04/07 (木) 14:50:12 - LPS 少し古いトピックですが、関連してると思うので。 Westen blotの発光試薬は、機械に載せる前に拭き取っていますか。フィルムじゃないので、濡れたままでいいので、自分はメンブレンに注いだまま、前後左右に傾けたりして均一になったらそのままキャプチャーしているのですが。 ラボの中でも、拭き取る人とそうでない人がいて、どちらかというと拭き取る人が多いようです。 皆さんはどうですか

(無題) 削除/引用 No.10356-19 - 2022/03/26 (土) 09:03:43 - GLUT4 発光試薬は経験上、 ECL select = Ncalai Chemi-Lumi One Ultra < Wako ImmunoStar LD です。 Immnuostarは強力ですが、バックグラウンドが高くなることもあるので、普段はChemi-Lumi One Ultraを使用しています。 一次抗体、二次抗体ともおおむね10000倍希釈で使用していますが、数時間は問題なく発光しています。

(無題) 削除/引用 No.10356-18 - 2022/03/25 (金) 19:07:16 - ghjk Immunostarを使ってます。シグナルが強くてバックグラウンドが低く、かつ発光の持続時間が長いので今までに使った中では一番良かったです。価格的にも購入しやすいし。

(無題) 削除/引用 No.10356-17 - 2022/03/25 (金) 16:40:46 - s https://images.app.goo.gl/7uNMHpMxqutUB5em6

(無題) 削除/引用 No.10356-16 - 2022/03/24 (木) 22:52:25 - TOKIO Amersham ECL selectを使う。 他の試薬とは桁違いにシグナルが強まります。

(無題) 削除/引用 No.10356-15 - 2022/03/24 (木) 10:15:55 - G25 >１時間とか長時間やるとなんか特有のバックグランドが出てきます。 露光しなくても見えてくる、CCD素子の個体ごと固有のバックグラウンドのムラですね（なんと言うのか用語は知りませんが）。これは予め無露光で記録したダークイメージとの差分をとるというフィルター処理で解消されていると思います。CCDが劣化してくるとバックグラウンドのパターンがかわることがあるようで、バックグラウンドが正しく減算されなくなります。交換修理やダークイメージの取り直しが必要になります（経験あり）。 あとは光子があたらなくても生じるノイズによる暗電流でしたっけ、これは確率的なものなので露光時間が長いほど多く乗っかってきます。暗電流を抑えるためにCCDを冷却したりするわけですが、CCDも品質が向上して、また最近はCMOSとかいうのが出てきたり（知らんけど）、暗電流ノイズも激減したように思います。数分程度の露光なら冷却しなくても暗電流ノイスは目立たないくらい。冷却すればo/nでもノイズは気にならないくらいになったと思います。 もっとも、長時間露光ができるか、品質がそれに耐えるかは製品によるでしょうけど。私のところではAP/CDPstar検出のサザン、ノーザンも用途に見据えていたので、それなりの製品を選びました。 まあ、長時間のカメラ撮影は、装置を長時間占拠してしまったり、アクシデントで振動を受けたり、性能面と言うより運用面であまりよろしくないですね。 >あとカメラとメンブレンの距離ですが、私はできるだけ底上げして（コニカルチューブについてくる発泡スチロールとかで）、ピントが合わせられる限界ぐらいまで近づけて取るようにしています 最近のバカチ○ン装置は固定焦点、被写体距離固定のも多いみたい。

(無題) 削除/引用 No.10356-14 - 2022/03/24 (木) 04:38:01 - おお 私の昔使っていたカメラは確か冷却はされてたと思うのですが、１時間とか長時間やるとなんか特有のバックグランドが出てきます。今使っているのは１時間ぐらいはやることがありますが、たまに真っ黒になりますね。抗体濃度とかCCDで撮影するように濃度調整しているからかなとか思いますが、、、でも今考えるとメンブレンだけでない、なんでだろう。１時間とかできないわけでもないんで、やることはありますけど。 長時間になると、あとに控えている人がいたり、朝来たらたまたま早起きしたやつが知らずに開けてしまったりとか、自分自身が複数のメンブレンがあったりとかで障害が多くいつもやれる状況でなかったりもしますね。 いまあるCCDカメラはフィルムと比べて遜色ないぐらいの感度になっているように感じます（あくまで感覚です）ので、カメラでとっても検出できるのかもしれませんね。 あとカメラとメンブレンの距離ですが、私はできるだけ底上げして（コニカルチューブについてくる発泡スチロールとかで）、ピントが合わせられる限界ぐらいまで近づけて取るようにしています。ピントはマニュアルで調整していますが、できるかどうかはついてくるソフトによるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10356-13 - 2022/03/23 (水) 23:51:23 - バイオレット >[Re:12] G25さんは書きました : > 青いのは本来、X線（放射線）用フィルムで、ケミルミ用に最適化したフィルムは透明ベースだった。今でも売ってるのかしら？　 > > 終夜露光で良くなるのはフィルム検出の場合限定ですか？ > CCD撮像装置でも、サザン・ノーザンやAP検出も視野にいれたものなんかだと、long exposureは可能ですけど。 > 在米です。青いの今も売ってて使ってます。これでもオーバーナイト露光でシグナル強くなります。とはいえ、既に指摘があるように透明フィルムの方がクリアに効果を感じられます。 自分の古い知識だと、CCD撮像装置はどうしても長時間露光に伴って熱ノイズの問題が発生するので、オーバーナイト露光なんて無理と思ってました。今は冷却装置をつけるなりなんなりで可能になったんでしょうか？long exposureというとどの位の時間できますか？

(無題) 削除/引用 No.10356-12 - 2022/03/23 (水) 10:11:47 - G25 青いのは本来、X線（放射線）用フィルムで、ケミルミ用に最適化したフィルムは透明ベースだった。今でも売ってるのかしら？　 終夜露光で良くなるのはフィルム検出の場合限定ですか？ CCD撮像装置でも、サザン・ノーザンやAP検出も視野にいれたものなんかだと、long exposureは可能ですけど。

(無題) 削除/引用 No.10356-11 - 2022/03/23 (水) 09:02:20 - み >[Re:7] iiiiさんは書きました : > フィルムなら露光を一晩する 青い安物フィルムでなくて高価なフィルムなら結構検出力が上がりますね。 皆さん仰るように持続時間も長い。 LASはカメラがメンブレンから遠かったりするからか感度低い。まあだいぶん機種によるけど。

(無題) 削除/引用 No.10356-10 - 2022/03/23 (水) 02:15:32 - おお >[Re:9] バイオレットさんは書きました : > >[Re:8] G25さんは書きました : > > 普通、発光寿命はそんなに長くない。PO/ルミノール系だと通常分単位。 > > 長発光寿命の改変試薬とかAP/CDPstarなんかを使えば別だが。 > > これ、確かに理屈上はその通り。ところが、不思議なことにFilmのオーバーナイト露光でシグナルが増強（バンドがはっきり見えるようになる）した経験がある人は多いと思う。 経験があります。なのでフィルム使って弱いときは一晩ホッ散らかしにしたりしています。特にECL以降のものだと減衰はするでしょうけど完全にシグナルがなくなるまである程度時間がかかるのかもしれません。あとフィルムの特性も手伝っているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10356-9 - 2022/03/23 (水) 00:11:32 - バイオレット >[Re:8] G25さんは書きました : > 普通、発光寿命はそんなに長くない。PO/ルミノール系だと通常分単位。 > 長発光寿命の改変試薬とかAP/CDPstarなんかを使えば別だが。 これ、確かに理屈上はその通り。ところが、不思議なことにFilmのオーバーナイト露光でシグナルが増強（バンドがはっきり見えるようになる）した経験がある人は多いと思う。長発光寿命の試薬ではないECL Picoとかを使った場合でも。 私は、まずは1秒〜5分位で露光したフィルムを数枚作ってから、念のためにと一枚フィルムを入れて一晩寝かせてから開けるようにしているけれど、このオーバーナイト露光のフィルムが一番シグナルが強く見えることが殆どだったりする。 一次抗体は4度で一晩、二次抗体も4度で一晩でやることが多く、かなり薄めの抗体濃度でやってます。

(無題) 削除/引用 No.10356-8 - 2022/03/22 (火) 21:50:58 - G25 普通、発光寿命はそんなに長くない。PO/ルミノール系だと通常分単位。 長発光寿命の改変試薬とかAP/CDPstarなんかを使えば別だが。

(無題) 削除/引用 No.10356-7 - 2022/03/22 (火) 21:39:41 - iiii フィルムなら露光を一晩する

(無題) 削除/引用 No.10356-6 - 2022/03/22 (火) 19:07:25 - TS みなさんのご意見がスタンダードと思います。 ファーストチョイスではないかもしれませんが、 Can get signalがうまくワークすることがあります。 細胞分画できそうな実験系なら、特定の分画を使う。

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