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(無題) 削除/引用 No.10358-9 - 2022/03/28 (月) 17:17:02 - S ＞G25さん 教えていただきましてありがとうございます。 死んだ菌の影響を抑える方法があるんですね。 benzonase処理有りとなしで、処理なしだけにでれば、死んだ菌由来と言えそうですね。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.10358-8 - 2022/03/26 (土) 18:28:02 - G25 死んだ細菌由来のDNAを軽減するためにbenzonaseなどのDNaseで前処理するという手があります。 https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-021-01067-0

(無題) 削除/引用 No.10358-7 - 2022/03/24 (木) 19:23:49 - M ＞おおさん 追加です。目的ですが、死んでいたとしても、ある菌がいたということが示せれば良いです（生きていても死んでいてもよい）。 菌が生きていれば、コロニーから検出の方が良いかと思いました。G25さんが言うように、シークエンス解析を行った方が良いので、コロニーからDNAシークエンスが良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.10358-6 - 2022/03/24 (木) 19:15:19 - M >おおさん 液体培地よりもコロニーの方がよさそうですね。 ＞G25さん ＞16S rDNAをPCRしてNGSでアンプリコンシークエンスする。 この方法、良さそうですね。DNAが混ざったまま（様々な細菌がいる状態）で解析できそうですね。これは、菌が死んでいる、あるいは、培養無しでも大丈夫なのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10358-5 - 2022/03/23 (水) 14:59:33 - G25 16S rDNAをPCRしてNGSでアンプリコンシークエンスする。 外注でも数万円でできると思う。 特定の細菌種特異的なPCRというのがかなり難しいだろう。大体の配列のホモログは広く共有されているものだから、特定の種由来だけPCRかけるというのは困難。多少のミスマッチならPCRかかってしまうし。 細菌種によって持っている遺伝子、持っていない遺伝子というのはあるが、特定の種しかもっていないという遺伝子はよほど特殊なものでなければないんじゃないだろうか。 バンドのある無しで判定するのは危険。 あと、コンタミネーション対策（増えたものが環境中の汚染由来である可能性の排除）も重要になってくるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10358-4 - 2022/03/23 (水) 14:06:50 - おお PCRするには使うサンプルで想定できるような量、状態で確実にPCRがかかるか検討してから実験をするべきだと思います。最近は培養できない菌も含めて環境などから回収して配列を読んでどんな菌がどれくらい分布しているか把握できるようにもなっているようです。 ＞例えば、菌が生きている可能性もあると考えて、、、でもよいのでしょうか。 横からになっちゃいますが、良いかどうかはあなたの実験の目的とかどんな結論を出すのかなどで判断するものだと思いますよ。 PCRのかかりやすさ、やノンスペの除外を考えるならコロニー拾ったほうが断然いいです。また下手に液体で培養するとあなたが考えている菌より増殖の早い菌があったとき、増殖の早い菌がドミナントになって余計PCRがかかりにくくなるかもしれません。 PCRは理想的には１コピー（菌で言うなら１匹）あれば増幅可能です。フィールドは違うにせよ数コピーの検出の系を立ち上げて動かしているというのもあるようです。慎重にやれば非常に高感度で検出できるのは事実です。

(無題) 削除/引用 No.10358-3 - 2022/03/23 (水) 11:43:20 - M ＞nonameさん 教えていただきましてありがとうございます。 例えば、菌が生きている可能性もあると考えて、液体培地にサンプルを混ぜて、菌を培養して、DNAをとってきて、精製してPCRで増幅するのでもよいのでしょうか。 それとも、サンプルと液体培地を混ぜて、その菌が含まれている液体培地を、寒天培地に播いて培養して、単一コロニーからDNAをとってきてPCRで増幅の方がよいのでしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.10358-2 - 2022/03/23 (水) 09:00:37 - noname まずPCRで増幅したものが目的の菌かどうかの確率はプライマーの設計次第です。 特異性が高ければ目的の物だけ増幅しますし、それでも他の種類も拾ってくる可能性もあります。なので今回のケースにおいてはPCRだけでの判断は良くないと思います。 PCRで増やした後、それをシーケンス解析するのがセオリー通りだと思います。 また、サンプルも夾雑物が多いとそもそもPCRがかからないこともあります。 そこそこの量があるのであれば、各メーカーいろいろなサンプルからの核酸精製キットを販売しているので、精製してからのほうがPCRはしやすいと思います。 ただその前にPCRという技術について基礎的なことを理解してから実験を行ったほうが良いと思います。

微生物の同定 削除/引用 No.10358-1 - 2022/03/22 (火) 22:23:49 - M 乾燥したサンプルからある微生物（細菌）がいるのか検証する実験を行いたいと考えています。サンプル表面についているであろう細菌のDNAをとってきて、PCRで増幅すればできるのではないかと思いました。 実験書などを読むと、微生物を培養してから、DNAを抽出してPCRをかけた方が良いと書いてありました。しかし、サンプル表面の菌は生きているかどうかがわからないので、培養できるかわかりません。 また、サンプルに様々な細菌のDNAが付着している可能性があります。サンプル表面からDNAをとってきて、様々な細菌のDNAがミックスされた状態で、プライマーを設計し、PCRでDNAを増幅して、アガロース電気泳動でバンドが出てきたとしても、目的の菌と言ってよいのでしょうか（別の菌のDNAが増えたりしている可能性もあるのではないか）。 もともとネズミや培養細胞を扱ってきたため、微生物に関しては、これまでにやったことがないので、勝手がわからず悩んでいます。 何か良い方法があったらよろしくお願いします。

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