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(無題) 削除/引用 No.10372-15 - 2022/04/04 (月) 15:23:24 - h あーすいません、皆さんの文章を再読して、色々勘違いしていることに気付きました。今までスレ汚しごめんなさいです。消すとほかの方の文脈が合わなくなるのでそのままにしておきます。 dCt平均・標準誤差の分布の差から出す、と捉えれば確かにddCt出せますね。私としては単純に、複数のdCt0-dCtn(これをddCtと考えていた)が出せるならば、その平均値・標準誤差を出せばいいじゃんと考えておりました。そもそも、分布の差をddCtと呼ぶのでしょうか？（素朴な疑問です）　勉強しなおしてきます。

(無題) 削除/引用 No.10372-13 - 2022/04/04 (月) 13:03:40 - s >[Re:12] hさんは書きました : > 仰る通り、dCtの平均から「頑張って」ddCtの標準誤差/偏差を出すことはできると思います。ただ、結果/計算値から最後に平均/偏差誤差を出すのが原則だと思いますよ。今回だと正規分布に従うだけの数はたぶんないですし、あったとしてもF検定必須です。というか計算不可でないのだからそんな仮定が必要だとは思わない。 全く対になっていないデータでも、対として平均値の差や標準誤差を計算せよ、そのほうが「原則(これもよくわかりませんが)」にかなっているから、という主張なら申し訳ありませんが私には理解不能です。 なお、私が仮定と言ったのは正規性の仮定ではなく、独立性の仮定(共分散が0かどうか)です。共分散が0でなくてもその分を引けば計算はできますが。

(無題) 削除/引用 No.10372-12 - 2022/04/04 (月) 11:04:47 - h >[Re:7] sさんは書きました : > >[Re:5] hさんは書きました : > > 前者ではn1-n5それぞれのddCtが出るのでn=5、後者ではn1-n5の平均からひとつの値を出すのでn=1と判断します。 > > 別に平均とったらサンプルサイズが1になるわけではないと思うけど。分布の差(差の分布ではない)だって、ある仮定のもとで標準誤差は計算できる。 仰る通り、dCtの平均から「頑張って」ddCtの標準誤差/偏差を出すことはできると思います。ただ、結果/計算値から最後に平均/偏差誤差を出すのが原則だと思いますよ。今回だと正規分布に従うだけの数はたぶんないですし、あったとしてもF検定必須です。というか計算不可でないのだからそんな仮定が必要だとは思わない。 >[Re:10] テスさんは書きました : > ただ、ボスの言うように各nでfold changeを取ってから統計を取れというのは、比率の積み重ねになるのでかなり違和感を感じています。 T1とC1、T2とC2、・・・でfold changeをとれ、と指示されているということでしょうか？　違うとは思いますが。 > 乱暴な言い方ですが、mRNAが4倍、5倍になるものは�僂tでもfold changeでも有意差は出ると思います。 そもそもqPCR自体が相対的な値しか出ない(cycle以外に単位がない)ので、何かを基準にしないと見にくい、分かりにくいというのが一般的な見解かと。スレ主さんが言うことはごもっともなんですけどね。 スレの本題とは違いますが、タンパクがまったく出ないのであればmRNAの有意差はあまり気にされなくても、と個人的には思います。有意差で言えるのは「等しくない」だけなので、sさんの論調で良いかと。その上でスレ主の主張（転写後調節）が説明できるデータがあればbetter。

(無題) 削除/引用 No.10372-11 - 2022/04/02 (土) 09:11:28 - s ・ΔCtやΔΔCtの誤差が正規分布すると仮定するのに違和感はないけど(正規分布の再生性により)、そうだとするとfold changeは対数正規分布することになる。したがって、通常のパラメトリックな検定をfold changeに適用するのは厳密には間違いだと思います。(だから両者で結果が異なる) ・ΔCtで検定を行ってfold changeで図示するのは、手順が明らかにされていれば問題ないと思います。 ・もしそのようなcontextで意図に反して有意差が出てしまった場合、自分なら、「差は有意であるが、現象(この場合はタンパク質の量差?)を全て説明するには効果量が小さすぎる」として論を進めると思います。

(無題) 削除/引用 No.10372-10 - 2022/04/02 (土) 00:32:40 - テス スレ主です。 私はこの論文で示されている方法で計算をしました。 https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262 個体はランダムに選んでいる（Treatedと書きましたが、実はmutantです。Controlもmutantもラボで大量に飼っているので、存在している中でその実験をする際にたまたま選んだ個体です。）ので、実験手法、逆転写効率などの違いを気にするならばCnとTnを比較するのも１つの考えではあると思いますが…。個体間には何の対応もありません。 私も�僂tで有意差を求めてよいとは思うのですが、どこまでコンセンサスが得られているのか分からない点と、ボス含めてfold changeの棒グラフでないと分かりづらいということでfold changeに直せと指示が来ています。 �僂tで統計を取ってからfold changeで示すのはおかしいと思うので、仕方なくfold changeで統計を取るのしかないのかな、と。 ただ、ボスの言うように各nでfold changeを取ってから統計を取れというのは、比率の積み重ねになるのでかなり違和感を感じています。 乱暴な言い方ですが、mRNAが4倍、5倍になるものは�僂tでもfold changeでも有意差は出ると思います。 現在私は、とある遺伝子のタンパク量はほぼ0になるが、それは転写後調節であってmRNAは変化しない、という仮定で実験をしています。それで、qPCRの結果fold changeでは約0.8倍（p=0.04）になるのですが、�僂tではp=0.1で有意差が出ません。そもそもタンパクは0である以上、mRNAが0.8倍になる、ということに特に意味を感じていませんが、論文に出す以上、有意差の有無は少し気になるので、どうすべきかと少し悩んでおりました。

(無題) 削除/引用 No.10372-9 - 2022/04/01 (金) 09:36:05 - s >[Re:7] sさんは書きました : > 何か勘違いしてるかもしれないけど、そもそもΔCtは各回ごとに計算しているのでしょうか。もしそうなら、ΔΔCtだけプールして平均値を求めるのも変な話。 ここのみ訂正。ΔCtは同じサンプルなので、各回ごとに計算するのは当然でした。

(無題) 削除/引用 No.10372-8 - 2022/03/31 (木) 20:40:02 - egeria ddCt法を採用する場合は、dCt値そのものに対して統計検定を行うのが適切だと思います。 今回のケースのようにサンプル間に対応がないなら、C1-C5のdCtとT1-T5のdCtについてwelch t-testを行うのがいいでしょう（wilcoxonでもいいですが）。あなたのおっしゃる方法だと、T1-T5のdCtから一律にC群dCtの平均値を引き、それが0と有意に異なるか一標本t検定を行うことになりますが、この場合はコントロールサンプルの分散が無視されるので、望ましくないです。 対応がある場合、n=1-5についてddCtを求め、これが0と有意に異なるか一標本t検定を行うわけですが、これは対応のある二標本t検定と全く同じ計算ですから、実際に比較されているのがdCt値であることに変わりはありません。 すでにご覧になっているかもしれませんが、このページで挙げられている資料は参考になるかと思います。 https://amphipod.hatenablog.com/entry/2017/06/15/215200

(無題) 削除/引用 No.10372-7 - 2022/03/31 (木) 18:03:27 - s 何か勘違いしてるかもしれないけど、そもそもΔCtは各回ごとに計算しているのでしょうか。もしそうなら、ΔΔCtだけプールして平均値を求めるのも変な話。 あと、 >[Re:5] hさんは書きました : > 前者ではn1-n5それぞれのddCtが出るのでn=5、後者ではn1-n5の平均からひとつの値を出すのでn=1と判断します。 別に平均とったらサンプルサイズが1になるわけではないと思うけど。分布の差(差の分布ではない)だって、ある仮定のもとで標準誤差は計算できる。

(無題) 削除/引用 No.10372-6 - 2022/03/31 (木) 17:15:25 - h 連レスすいません。もう一度見たら整理すべきかなと。 １．各サンプルのddCtを求めてその平均を計算するべきか、各サンプルのdCtの平均からddCtを求めるべきか ２．同時に取得したサンプル同士で比較すべきか このふたつの質問があると考えて宜しいでしょうか？ １については前述。ちなみに、各サンプルのdCtを求める方法は全部のcDNAを等量混合してqPCRかけるのと意味合い的には同じかと。 ２は、n=1〜n=5が同条件ならば同時サンプルとの比較でなくても良いですが、n1の個体数が各1より大きければ繰り返し実験としてn1を1標本とした方が良いかも。つまりサンプル数を複数にする代わりにサンプルサイズを分けるということです。

(無題) 削除/引用 No.10372-5 - 2022/03/31 (木) 16:46:14 - h どちらが正解ということはないのでしょうが、私は数学的な観点からは前者をおすすめします。 前者ではn1-n5それぞれのddCtが出るのでn=5、後者ではn1-n5の平均からひとつの値を出すのでn=1と判断します。またddCtの偏差/誤差の計算は各ddCtに対して行うので、後者では出せないか、もしくは平均と異なる計算方法になると思います。それはどうなのかな、と。 もちろん、この実験系n1-n5を複数回繰り返すのなら後者の方が良いと思います。 まあ、生化学の論文でそこまで述べてる人はいないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.10372-4 - 2022/03/31 (木) 13:27:00 - asan これはぶっちゃけどちらが正解不正解というものではなくて、どこに対応づけるかどうかの問題でしかないかと。どちらのやり方が必ず間違いとまでは言えない。 別の日に解析したペア間の差に関して対応した比較がしたいのか、あくまで同一のレプリカの群同士の差を取りたいだけなのかの違いだと思います。前者は個体同士のペアの差に意味をもたせてるわけで、後者はあくまでコントロール群との差に意味を合わせてるだけです。

(無題) 削除/引用 No.10372-3 - 2022/03/31 (木) 10:14:18 - seventh CnとTnが別個体の場合は対応がないので後者。 一応個体差よりサンリング時の環境の変動の方が大きいなら前者の計算でもありえないことはないですが、飼育サンプルの場合環境はほぼ一定に保たれているはずなので。

(無題) 削除/引用 No.10372-2 - 2022/03/31 (木) 04:07:30 - おお qRT-PCRで一定RNA量を使ってもそのCt値が正確に量を反映しないだろうという懸念のため Internal controlを使った手法が使われるのが一般的な手法になっている理由です。毎回の、あるいはサンプル間のRT効率が一定である保証がないからです（そういう性質のものだという考え方です）。ですからサンプル毎にdCを取るのがベストであります。 でも、毎回のInternal controlの値があなたの見たいものの差に比べてブレが少ないならInternal controlも平均を取って計算する事について私は否定しません。

ΔΔCt法の統計解析 削除/引用 No.10372-1 - 2022/03/30 (水) 20:08:22 - テス ΔΔCt法の統計解析について質問があります。 当研究室はPCRを数年に１回しか行わないレベルなので誰かに聞いて疑問が解決できず、皆様のお力を貸していただきたいです。 １日に１回、Control groupとTreated groupのマウス（別個体）の肝臓をすり潰して、mRNAをキットを用いて抽出、cDNA変換をします。（それぞれのサンプルをC1,T1とする） これを５日繰り返した後にΔΔCt法でリアルタイムqPCRを行い（１回のPCRにC1〜C5、T1〜T5のサンプルをかける）、遺伝子AのmRNA量に変化があるかをInternal Control遺伝子Bでノーマライズして計算します。 研究室のボスの考えは、「CnとTnでΔΔCtn（n=1〜5）を求めてその平均を計算するべき」なのですが、私は5つのサンプルのΔCtの平均を取り、その後にΔΔCtを求めるべきだと考えています。（複数の論文を読んでからの考察） 同時に取得したサンプル同士で比較すべきだ、というのは正しいのでしょうか？ 加えて、ΔΔCt法の具体的な統計解析について書いてある便利な論文や本があれば教えていただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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