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ありがとうございました。 削除/引用 No.10374-8 - 2022/04/15 (金) 03:42:29 - フローサイトメトリー初心者 お返事遅くなり申し訳ありません。 懇切丁寧な説明で非常に助かりました。 今後は自家蛍光の出たチャネルは使わないようにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10374-7 - 2022/04/06 (水) 14:03:40 - tt 1. はい。自家蛍光が発生した場合は、そのチャンネルは自家蛍光観察用として用い、蛍光標識を用いないのがよいと思います。場合によっては、自家蛍光を発している細胞集団のフェノタイプを同定すればデータになるかもしれません? 他の先生のデータを覗くことはできませんが、PE の自家蛍光は例えば単球、マクロファージ、樹状細胞などが炎症と関連して発することがあるので、私でしたら興味を持つと思います。 2. マルチカラー FACS で検出器 (センサー) の電圧を調節するときは、補正 (コンペンセーション) のバランスが重要です。 たとえば、あるサンプルを観察していて FITC の蛍光が PE のチャンネルに漏れこんだとします。(PE-FITC) の compensation matrix を comp beads で設定したところ、150 % となり、100 % を超えてしまったとします。この場合どうすればいいでしょうか? 答えとしては、PE の電圧を下げる or FITC の電圧を上げる or 両方です。このようにして compensation matrices を 100 % 未満にすることができます。これをすべての蛍光補正について行います。もちろん、小さければ小さいほど SN 比が良くなるので、 全ての compensation matrices の最大値をなるべく低く (例えば 50 % 未満を目安に) するような方法が、データ全体の質を担保するうえで堅実であると考えています。

(無題) 削除/引用 No.10374-6 - 2022/04/04 (月) 04:04:05 - diego 追記 PE関連のpositive populationに関しては自家蛍光を示す組織を含有しているといると愚考しております。 サンプルは腎臓です。同じvoltageで脾臓の場合は認めませんでした。

ボルテージ関して 削除/引用 No.10374-5 - 2022/04/04 (月) 03:37:22 - diego tt様　 非常に理解しやすい説明でとても助かります。 またいくつか質問をさせていただきたいのですがよろしいでしょうか。 �@先日至適濃度を決定するために単染色を使用しタイトレーションを行ったのですが、PE、PE-cy7チャネルでnon-stainサンプルにおいてpositive populationを認めました。 最近PE関連チャネルでFMOを使用してもcut lineが同定できなかった原因がこれだと思うのですが、このような場合PEチャネルは避けてパネルを組んだ方がよろしいでしょうか？ このチャネルでgateする予定の細胞がなかなか少ないpopulationなのでできる限りノイズは避けたいところではあります。 �A至適なvoltageの決め方に関して色々文献を調べているのですがこれだという方法が見つけられません。tt様は普段どのようにvoltageを決められているのでしょうか？ tt様のご意見をいただけたら助かります。 大変お忙しい中誠に恐縮ですが何卒よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10374-4 - 2022/04/02 (土) 12:10:50 - tt diegoさんが意味する「濃度」という言葉の意味にもよります。 適切な蛍光標識抗体の濃度は、もちろん titration をしないと見つけられません。ただし、データが取れさえすれば完璧でなくてもいい場合もあります。その場合は適当にやります。 また、明るい蛍光標識と暗い蛍光標識、製品ごとの品質、ロット差なども影響する場合があります。 さらには、業界の慣習として抗ヒト抗原抗体と抗マウス抗原抗体で売り方の違いがあります。ヒト抗原に対する抗体の場合、"5 μl (or 20 μl) per test" という表記で売られることが多いのに対し、マウス抗体は一般に "xx mg per ml" という表記で売られます。前者の場合、メーカーによって実際の濃度を公開しているところとしていないところがあります。 以下のやり方は本当に人それぞれなので、あくまで御参考としてご覧ください。 私の場合、ヒト抗原に対する抗体については、0.1 test per 50 μl (染色バッファー) から始めて、明るすぎるものは減らし、暗すぎるものは増やします。 マウス抗原に対する抗体については、たとえば 50 ng per 50 μl (染色バッファー) から始めて、同様に条件検討します。 PE, APC, BV421 のような明るい蛍光標識の場合、だいたい上記のやりかたで OK ですが、ときどき想定外に蛍光が明るくて saturation を起こしてしまい、さらに 100 倍希釈するようなケースも稀にあります。 FITC, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7, Alexa 700, Pacific Blue のような暗い標識の場合は、比較的濃度を高くする場合があります。

ありがとうございました 削除/引用 No.10374-3 - 2022/04/02 (土) 01:37:10 - diego 迅速な返信感謝いたします。 わかりやすい説明でよく理解することができました。 もう一点お聞きしたいことがありまして回答者さまは抗体使用時原則何倍希釈で使用されていますでしょうか？もしくは基本的に使用時は全てタイトレーションを行い各抗体毎に濃度を変えて使用されていますでしょうか。 ご教示のほど何卒よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10374-2 - 2022/04/01 (金) 21:15:01 - tt >ビーズに加える抗体の量は実際にサンプルに投与している量と同じにするのか フローサイトメーターの設定が一定であると仮定すると、粒子 (細胞) の蛍光強度は蛍光を発する蛍光分子数で決まります。それは、細胞の場合は抗体が特異的に結合する抗原の発現量と相関しますが、comp beads の場合はビーズ表面が抗マウス抗体(*)でコートされており、任意のマウス抗体を結合します。この場合、蛍光標識抗体の濃度を濃くしすぎると抗マウス抗体に蛍光標識抗体が結合しすぎて、蛍光強度が振り切れてしまうことがあります。一概にはいえませんが、細胞を標識する場合よりも薄める感覚で条件検討をすることが多いです。 (*) ヒト細胞を標識する抗体はマウス抗体の場合が多いです。マウス抗体は抗マウス抗体に補足されます (抗マウス抗体抗体といったほうが正確かもしれないけど) 一方マウス細胞を標識する抗体はラット抗体が多いので、抗ラット抗体でコートされている別の comp beads を購入しないといけません。なお、上記は一般論であり、たとえばヒト細胞を抗ラビット抗体で標識する場合などもあります。それぞれに適合した comp beads を用意しなければなりません。 >タンデム色素の場合ビーズは使用できるのか 一般的には使えます。 >ビーズ使用時のネガティブ集団はネガティブビーズの集団か、無染色の集団か 一般的には、1 つのチューブに comp beads (抗マウス抗体でコートされたビーズ) と negative beads (表面がコートされていないビーズ) を両方加えて、そこに蛍光標識抗体を加えます。無染色の comp beads をネガティブ集団に使うというのは、必ずしも一般的ではないです。

コンペンセーションビーズに関して 削除/引用 No.10374-1 - 2022/04/01 (金) 08:14:24 - diego お世話になります。 フローサイトメトリー初心者のものです。 compensationに関して何点が教えていただきたいことがありまして投稿させていただきました。 現在compensationする時にビーズを使用しているのですが ・ビーズに加える抗体の量は実際にサンプルに投与している量と同じにするのか ・タンデム色素の場合ビーズは使用できるのか ・ビーズ使用時のネガティブ集団はネガティブビーズの集団か、無染色の集団か どなたかご助言いただけたら助かります。 何卒よろしくお願い申し上げます。

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