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(無題) 削除/引用 No.1038-13 - 2012/10/20 (土) 10:47:18 - 774 てっきり自分で上手く読めた時は一般的な条件でやったもんだと脳内変換してました。 すみません。 それ以前に、みなさんが仰るように波形の確認ですね。

(無題) 削除/引用 No.1038-12 - 2012/10/20 (土) 10:36:33 - おお >[Re:11] Harmoniaさんは書きました : > おおさんの質問、 > > >> 帰ってきた結果は滅茶苦茶外れてましたので、 > >外れてたって違う配列だったって事ですか?読めてたってことでしょうか? > 表現から今考えてみると、70%ぐらいはあっていてあとはNとか違う塩基が入ってたりとかそんな感じかもしれないと思ったけど、、、どうでしょうか質問者さま。 そうだとすると反応があまりうまくいってませんよね。

(無題) 削除/引用 No.1038-11 - 2012/10/20 (土) 09:35:20 - Harmonia おおさんの質問、 >> 帰ってきた結果は滅茶苦茶外れてましたので、 >外れてたって違う配列だったって事ですか?読めてたってことでしょうか? に答えてください。 で、違う配列だったとして、きれいなデータだったのでしょうか？ATGCのテキ ストの結果だけを見て仰っているのか、波形を見て仰っているのか？ 貧弱な波形データでも文字情報にされてしまうと、別物の配列が見えることは 有ります。 読めなくなる経験はありますけど、おなじテンプレートとプライマーの組み合 わせなのに反応条件を変えただけで違う配列が「きれいに」出てきた経験はあ りません。 シーケンスプライマーも外注ということですから、T7等の一般的なプライマー ではなく、見たい配列に特異なプライマーでしょうか？ベクターに良くあるプ ライマーなら、クローンを間違えると「きれいに」違う配列が出てきます。 でも、見たい配列特異的に設計したプライマーなら、「違う配列」が出ること が想像できません。

(無題) 削除/引用 No.1038-10 - 2012/10/20 (土) 01:22:05 - おお 確かにテンプレートが多すぎるとはおもいますが、同じことをして委託したところではかからず、貴方がやるとかかるわけですよね。。。それなら委託したところに文句言ってもいいかもしれませんけど、、、それでお金払っているのはちょっと納得が行かないでしょうし、、、 話はかわりますが、なぜRNAが混入しているって分かったんですか。ただ、シーケンシング自体はそんなにRNAの影響は受けないと思いますけど。。。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2681

(無題) 削除/引用 No.1038-9 - 2012/10/19 (金) 23:06:25 - KEN テンプレートDNAがやや多すぎだと思いますが、その条件でご自分でシークエンス反応されてうまくいっているならば、原因ではないのでしょう。 精製後のテンプレートDNAは泳動で確認されているでしょうか？ 私も急いでいる＆検体数が多い場合は、業者に頼むことがありますが、プレミックスタイプは何となく抵抗があり(そこまでやるなら自分でシークエンスまでやろうと考えてしまう)、プライマーと検体別々で頼むことが多いです。 自分は、マク◯ジェンジャハ◯ンに頼んでいますが、大丈夫な感じです。 輸送方法は何にしましたか？冷凍ですか？ 常温で発送すると、精製済みのDNAは分解が進むので、シークエンスの失敗率が増えます。

(無題) 削除/引用 No.1038-8 - 2012/10/19 (金) 18:41:25 - 774 template DNAの量が多すぎませんか？ 数百ngあれば十分かと。 受託先の指定なんですかね？

(無題) 削除/引用 No.1038-7 - 2012/10/19 (金) 16:40:48 - 初心者 皆さんの意見は大変参考になりました。 事情を詳しく説明しなかったのは私のせいですので、 少し詳しく言いますと、 cKOマウス作製用のターゲティングベクター(全長17kb) をコンストラクションした後、うちの研究室の助教が プライマーを外注して届きまして、 私は助教のアドバイスにより、プレミックスを準備し、 ある会社にシーケンシングを依頼しました。もちろん、 依頼もその助教が行ってくれました。 プレミックスの組成ですが、一サンプルあたり、 テンプレートDNAは7.5μg、 プライマーは25pmol、 全体が21μlになるようにミリQでメスアップしました。 ちなみに、TEは含まれていません。 細心の注意を払って準備したので、入れ間違いはないと思いたい。 テンプレートDNAはRNaseA未処理で、A260/280=1.89です。

(無題) 削除/引用 No.1038-6 - 2012/10/19 (金) 15:57:14 - おお >[Re:3] 初心者さんは書きました : > アドバイスありがとうございます。 > > シーケンシングは外注なので、詳しい方法はわかりません。 いや、そんな事はないとおもいますが、、、勿論水はミリQをつかったか、市販のヌクレアーゼフリーの水を使ったかとか細かいことを言い出すと分からないことも出てくるでしょうけど。そのそも何やっているか分からないところに外注だせますか?よっぽど技術的に難しいことでも大体の事を把握して外注しないと、、、 > 帰ってきた結果は滅茶苦茶外れてましたので、 外れてたって違う配列だったって事ですか?読めてたってことでしょうか? > > 自分なりに同じサンプルをRNaseA処理して、 ここに何か入ったりしませんか?RNaseA処理のあとフェノールクロロフォルム処理したとか、えたチンしたとか、、、 > > サイクルシーケンシング法で行ってみた結果、 > > バッチリ合ってました。

(無題) 削除/引用 No.1038-5 - 2012/10/19 (金) 15:51:57 - み キアゲンのMaxiで調製したDNAをtemplateにしてシーケンスしてますが、問題ないです。 RNaseA処理はプロトコール通りP1 bufferに添加しているだけです。

(無題) 削除/引用 No.1038-4 - 2012/10/19 (金) 15:05:44 - in situ 何やらRNaseA処理にこだわっているようですが、本当にそれが原因でしょうか。 RNaseA処理なしのサイクルシークエンスは試してみましたか？ トラブルシューティングの場合、結果がでればよいのですが、思い込みで原因を決めつけるのは危険です。 委託したならば、委託先にも原因（候補）を尋ねてみるとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1038-3 - 2012/10/19 (金) 14:35:20 - 初心者 アドバイスありがとうございます。 シーケンシングは外注なので、詳しい方法はわかりません。 帰ってきた結果は滅茶苦茶外れてましたので、 自分なりに同じサンプルをRNaseA処理して、 サイクルシーケンシング法で行ってみた結果、 バッチリ合ってました。

(無題) 削除/引用 No.1038-2 - 2012/10/19 (金) 02:00:12 - おお >[Re:1] 初心者さんは書きました : > マキシプレップ用キットを使用する際、大腸菌ペレットを溶かすバッファーに予めRNaseAを溶かすのですが、その結果、調製してきたプラスミドDNAをシーケンシングに使用する際、再びRNaseA処理する必要はありますか？RNaseA処理なしの場合、シーケンシング結果はデタラメになりますか？ 必要はないと思いますが。。。どのようなシーケンスメソッドと使うのでしょうか?RNAがまだ残っているとお感じならやってもいいかもしれませんが、そのキットでそんなにキャリーオーバーがあるもんなんでしょうか。もしRNAが残っているなら260nmでのDNA量の見積が低くなる可能性があります。

シーケンシングについて 削除/引用 No.1038-1 - 2012/10/18 (木) 21:55:03 - 初心者 マキシプレップ用キットを使用する際、大腸菌ペレットを溶かすバッファーに予めRNaseAを溶かすのですが、その結果、調製してきたプラスミドDNAをシーケンシングに使用する際、再びRNaseA処理する必要はありますか？RNaseA処理なしの場合、シーケンシング結果はデタラメになりますか？

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