0.99にすることにこだわる必然性があるのか正直疑問ですが、ぶっちゃけあくまでできるだけ正確な定量がしたいというのが趣旨ならばより多くの点をとって検量線をひけばいいんじゃない？って気がしますけどね。同じ点のtechnical レプリカをとるのも誤差を減らすという意味では効果的です。
ウエスタンの定量なんていくらきちんとやったところで結局は抗体のバンド画像の目視の濃さに引きずられますからこだわりすぎても意味がありません。検量線がガタガタなら問題ですが、検量線の信頼性の高い範囲の濃度で定量して、その後に正確に希釈する行為の方がはるかに重要です。
科学的に発表するなら議論があるともいますが、スタンダードの検量線をできるだけ多点、できれば複数点をとって、明らかにおかしい（調整誤差）と思われる点は省いて検量線を引けばいいだけじゃないのかな？あくまで検量線であるなら検出感度が際どいところやサンプルの濃度が濃すぎるところで微妙な差を取るより、信頼性の高い範囲を使用することの方がはるかに濃度の正確性は高いです。当然薄くしすぎればバックの反雑物の影響も受けるし、濃すぎるとチップの先についた少しの濃度の誤差も影響します。
たまに、吸光度系の検出がおかしくなってるとか、96 wellとかでやってるなら特定の位置だけ値がぶれやすいとか機械的なトラブルが原因になることもあるのでその場合はメンテに出すとかで改善するかもしれません。
人によっては検量線を3点とか4点ぐらいで定量してて問題ない人もいますけど、自分の感覚的にはできるだけ多くの点を取って、場合によっては外れ値をのぞいた方が再現性は高い検量線は出せると思います。 |
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