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(無題) 削除/引用 No.10385-8 - 2022/04/16 (土) 18:34:23 - fty SDS-gel作って冷蔵庫にしまってるけど濃度的にも低いからかSDS析出したことないです。尿素は濃度がほぼ飽和に近いので冷蔵庫に入れると析出しやすいです。

(無題) 削除/引用 No.10385-7 - 2022/04/13 (水) 00:16:24 - おお >[Re:5] tricine系さんは書きました : > なるほど。自分の場合はバンドの移動度の違いからリン酸化を検出するのですが、かなり際どい差であるため、ゲル下端ぎりぎりまで泳動しています。 > > 確かにSDSが析出してくるのはその通りですね！失念しておりました。 SDSPAGE内でのSDSは比較的安定して溶解しているようなきがするので、析出しますというよりは、析出する懸念があると思った次第です。ゲルの中に尿素とか入れておくといいのかもしれません。 > > 別の観点の質問なのですが、低分子量側になってくると、かなりバンドがぼやけてしまうのですが、これの対処法は何かありますか？ > https://www.nature.com/articles/nprot.2006.4 これのFig２のdのような三日月みたいなバンドのことですか？非常に低分子でUreaが入っていたら特にそういう傾向が強いです。またサンプルの処理の仕方でも変わってきたりします。何が原因かわからないのですがHot lysis bufferでそのような傾向がみられRIPAでは見られなかったりもして、、、デタージェントのミセルの違いがでるのか、、、実際のところできるのかと思ったことがあります。 もしこのような形状の話でなければゲルにグリセロールを（入れてなかったら）入れてみてください。オリジナルは入れてるようですね。尿素も効果があるにはありますが、非常に小さいものであれば上記のようなバンドの形状になることが多いです。あと裏技的なものがあるにはありますが、、、 tricine以外の系で低分子が見れるものがありますが、見様見真似でやってみたところtricineのほうが断然バンドがシャープではあります（という印象）。 ＞転写後にメンブレンをボイルするのはなぜですか？ アミロイドなど、構造的なものが要因で抗原性（抗体認識部位の露出）などでボイルが有効な場合があるようです。普通はしません。低分子の膜の保持力を考えるなら、膜の乾燥や微量ぐるたるアルデヒトなどでの固定を考えて見てはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10385-6 - 2022/04/12 (火) 15:35:21 - tricine系 追加の質問です。 転写後にメンブレンをボイルするのはなぜですか？ 自分の解釈では、低分子量帯のタンパク質をメンブレンに完全に結合させるためと考えていますが、その解釈で正しいのでしょうか。 また、他に検出感度を上げる方法がありましたら、教えて頂けると助かります。

(無題) 削除/引用 No.10385-5 - 2022/04/12 (火) 15:32:10 - tricine系 なるほど。自分の場合はバンドの移動度の違いからリン酸化を検出するのですが、かなり際どい差であるため、ゲル下端ぎりぎりまで泳動しています。 確かにSDSが析出してくるのはその通りですね！失念しておりました。 別の観点の質問なのですが、低分子量側になってくると、かなりバンドがぼやけてしまうのですが、これの対処法は何かありますか？ glycine系でも検出できるような分子量帯でははっきりとバンドが現れるので、泳動の乱れではないと思っています。

(無題) 削除/引用 No.10385-4 - 2022/04/09 (土) 23:00:13 - vgβhに オーバーナイトでやれるようにうまいこと通電条件合わせるとかは。帰りがけにstartして朝来た時いい感じのところになるように。ゲル濃度が高いのでそう簡単には拡散しなさそうだし。 市販品もあったと思う. ああいうのはいろいろ工夫されてることが多いので、短時間でもいけるのかもしれないからちょっと調べてみれば。

(無題) 削除/引用 No.10385-3 - 2022/04/08 (金) 05:15:32 - おお Tris-Tricineの系はゲルのバッファー濃度が高いため、Tris-glycineと同じ電圧でも流れる電流が多く、より熱が発生します。しかしながらバイオラッドなどのミニゲル（一辺が８とか９cmぐらいですかね）でバッファーがゲル板全体に接触しているような泳動装置であれば１００Vは可能な電圧だと思います。一応熱くなりすぎてないか随時チェックするようにしておけばいいでしょう。コールドルームとかで低温の環境で流しても大丈夫と思いますが、SDSの沈殿がちょっと心配です。サンプルロードからしばらくは室温で流したほうがいいかもしれません。その後は氷詰めでも、ある程度熱を発生するので行けるかなと。一応そういう場合はスターラーでバッファーを循環させてなるべく温度むらとかないようにしたほうがいいと思います。 冷却に関しては冷却水を循環させるようなパイプが装着できるようなものも（特におおきなゲルだと）あるようですが大層なセットになってしまうかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.10385-2 - 2022/04/08 (金) 00:37:30 - 独り言 Tricineでやってましたが、１００Vでやっていたので、普通に100分ぐらいで永動していました。 室温で。

tris-tricine系sds-pageは長くて。。。 削除/引用 No.10385-1 - 2022/04/07 (木) 18:52:21 - tricine系 tris-tricine系のsds-pageを行っていますが、電気泳動の時間が長くて困っています。 glycine系の電気泳動に比べ、低い電圧で行うのですが、これは発熱を抑えるためなのでしょうか？ その場合、4℃室で電気泳動を行えばより高い電圧で電気泳動を行うことができ、時間短縮につながると考えています。 皆さんはこの方法に賛成して頂けますでしょうか？ 経験のある方など、教えて頂ければ助かります。

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