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(無題) 削除/引用 No.1041-7 - 2019/09/30 (月) 22:07:17 - PP 今見ている結果が正しいかもしれません。シグナル伝達経路の模式図見てもらうと、上流ほど、いろんなとこから線が伸びていて、下流に行くにつれどこかにコンバージしてくるのがわかると思います。あなたが考えるルートとは別の経路から、という可能性はありませんか。

(無題) 削除/引用 No.1041-5 - 2012/10/20 (土) 01:09:05 - おお 燐酸か、非燐酸かに限らず認識する抗体でIPご、燐酸か特異的抗体で検出。あるいは抗体のIPなどの相性によってはその逆 もう指摘がありますが、そういう方法はとれますね。phos-tagなどを組み合わせて特異的抗体を使わないというてもあると思います。

(無題) 削除/引用 No.1041-4 - 2012/10/19 (金) 23:42:03 - ab 目的タンパク質の発現量自体が減っていることはないでしょうか？ ものによっては、リン酸化後に分解されるのもありますし。 リン酸化したものも含めてトータルの目的タンパク質の検出はできてますか？ あとは、計時変化も見た方がよいです（5分くらいから）。 お金があれば検出試薬を高感度のものに変える。 バックグラウンドや泳動の乱れを気にしないなら、ロードするタンパク質量を増やすのが簡単でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1041-3 - 2012/10/19 (金) 22:47:28 - KEN KYさんの書かれているとおりかと思いますが、検出試薬を変えるというのも手かと。 ECLでの検出であれば、GEのSelectを使ってみるとか。 ただ、上記方法で検出できたとしても、他の細胞株では検出できて、その刺激した細胞で検出出来ないのであれば、リン酸化率が低いと考えるのが自然ではないでしょうか？ 下流のリン酸化に関しては、刺激によって別の経路が動いている可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1041-2 - 2012/10/19 (金) 21:59:00 - KY １、発色液を強いものにする。 ２、抗体濃度を上げる。 ３、ブロッキングを弱いものにする ４、一次抗体をオーバーナイトにする。 ５、IPして濃縮する。 バックグランドや目的にもよると思いますが。

ウエスタン・ブロットのバンド検出について 削除/引用 No.1041-1 - 2012/10/19 (金) 21:01:08 - tomi 現在、ウエスタン・ブロットでの実験を行っているのですが、バンドが検出できず困っています。 動物細胞にサイトカインで刺激を加えて回収後、ウエスタン・ブロットにてリン酸化たんぱく質を見ているのですが、バンドが検出できません。 他の細胞株では検出できているので、抗体のせいではないと思います。 また、下流のたんぱく質のリン酸化は確認できているため、刺激がかかっていないということもないと思っています。 シグナルがとても弱く検出できないのでは？と思っているのですが、弱いシグナルを検出する方法などご存じでしたら教えていただけないでしょうか？

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