全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10420-12 - 2022/04/27 (水) 06:57:22 - おお CBBやポンぞーの染まり具合から量を調整するのなら、たんぱく定量しているのと本質変わらないからまあそれでもいいかなと思います。CBBってBradfordで使われる色素と同等かほぼ同等のものを使っているわけですし。 しかし、基本的には変だと思ったスッテップからやり直すのが筋だと思いますし、そうすることで何が悪くてどうすればいいのかなどわかってくるということもあるでしょうから。 たまたまたんぱく定量の見積もりが変だったならそれほど影響がないでしょうけど、抽出効率が大きく違うと比較も怪しくなります。色々考えたほうが良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.10420-11 - 2022/04/27 (水) 01:03:35 - vvv G25さま つまり、濃度計測して再度合わせるというよりも、バンドの濃さで合わせるという意味でしょうか？ 正直、同時に濃度計測を再度行ってもうまくいくとは思っていないので（恐らく、サンプルと時間を消費して、メンタルがヘラるだけ）、上記手段を考えてもいました。しかし、これによって出た結果がどれだけ信頼できるのかを考えていたので、助かるコメントです。 手のいい人なら別々にやっても、いつやっても、安定しているものです。 →理想はそうですね（現実はラボ運営との関連で色々あります）。現実と理想のギャップを理解されたうえでのコメントありがとうございます。G25さまがきちんとキャリアを積まれた方なのだと想像ができ、信頼すべき方なのだと確信できました。

(無題) 削除/引用 No.10420-10 - 2022/04/26 (火) 22:34:53 - bkjんlk 高齢マウスおよびラット　（＞２５ヶ月）の肝臓からタンパク質の抽出、タンパク質定量、western blotting等を日常的にしてました。これらの実験過程で若齢群と比べて明らかな差異は感じたことないです。同じようにできます。少なくともタンパク質定量で倍も違うようなことはなかったです。 見かけだけでなく若齢と老齢でのタンパク質構成も１次元の電気泳動では少なくとも目視ではほとんど違いはわかりません（ただ雄ラットではよく知られている性ホルモン依存性のタンパク質が少なくなってるくらい）。もしろんさらに分子レベルで調べればそれなりに変化があるのですが。 肝障害病態モデル動物とか肝臓に異常が出る系統とかだとどうなるのかはわからない。

(無題) 削除/引用 No.10420-9 - 2022/04/26 (火) 16:56:54 - み >[Re:8] G25さんは書きました : > 極端に収量が異なる場合、単に量的に差がついているだけでなく、定性的にもなにか違っている、相転移のようなことが起こっている可能性もあります。 > 例えば、一方ではある種のタンパク質だけ抽出効率が低いとか、微量のタンパク質がすっぽり抜けているとか、すべてのタンパク質が同じ割合で増減しているのではないかもしれません（もちろん処理群によってもともと量が異なるタンパク質以外で）。 > > なので、極端に収量が低いようなサンプルは使わないに限りますけど。 同意します。 肝臓は歳取ると脂肪含有量が高くなるし蛋白抽出法や遠心のg数を適切に設定しないと蛋白以外の混入で正確な蛋白濃度が見積れなくなる。 脂肪のほか血液混入度合いも影響するし、組織重量辺りに使用したbuffer volumeが異なるだけで抽出効率が違ってくる。蛋白量合わせてロードしただの、internal controlで補正するだのと言われても駄目ですよ。 なのでいい加減な手技で取得されたサンプルは「信用できない」とコメントしました。

(無題) 削除/引用 No.10420-8 - 2022/04/26 (火) 16:01:48 - G25 極端に収量が異なる場合、単に量的に差がついているだけでなく、定性的にもなにか違っている、相転移のようなことが起こっている可能性もあります。 例えば、一方ではある種のタンパク質だけ抽出効率が低いとか、微量のタンパク質がすっぽり抜けているとか、すべてのタンパク質が同じ割合で増減しているのではないかもしれません（もちろん処理群によってもともと量が異なるタンパク質以外で）。 なので、極端に収量が低いようなサンプルは使わないに限りますけど。

(無題) 削除/引用 No.10420-7 - 2022/04/26 (火) 15:40:32 - G25 >２）数値上はハウスキーピングで補正を行うので気にしない ウェスタンのバンド強度は定量的にリニアでないので、強度が極端に異なるサンプル間の補正には使うべきでありません。 濃度測定の値がどうであれ、泳動ゲル（またはブロット）を染めたときの染色強度がなによりタンパク質の量を反映しているはずです。一つのやり方としては、各サンプルを希釈列で泳動して、染色あるいは内部標準タンパク質のイムノブロットの強度が釣り合う条件を決めてから本実験をするというのもあります。そうすれば、 >３）論文に乗せるのに、画像を出すのに神経を使うので、なんとかする も解決。 >１）再度抽出を同時に行う 必ずしも、同時にやる、side-by-sideでやる必要はないと思いますし、そうしたからと言って解決するとも限らない。手のいい人なら別々にやっても、いつやっても、安定しているものです。

(無題) 削除/引用 No.10420-6 - 2022/04/26 (火) 14:14:13 - bkjんlk タンパク質定量やり直して再実験すれば住むだけですので、特に悩むようなことではないと思いますが、タンパク質定量を含め泳動用試料の準備の段階でまずいことがあると同じことを繰り返すことにだけになるので、以下の点確認ください。 抽出bufferはどのようなものを使用されていますか。 抽出後は遠心して不溶物は除去していますか。 ホモジナイズの際の、組織と抽出bufferの大体の体積比はどのくらいでしょうか。 タンパク質濃度が高すぎて、検量線の直線性のある範囲から外れたところで見てませんか。

(無題) 削除/引用 No.10420-5 - 2022/04/26 (火) 11:02:29 - vvv qqさま お返事ありがとうございます。 はい、条件1,2です。正確には若齢と高齢です。なお対象は肝臓組織です。 まずは、1)で再度同時に濃度計測して、SDS-PAGEを再度行ってみます。 それでもどうにもならない場合は、諦めて2)といった流れでやってみます。

(無題) 削除/引用 No.10420-4 - 2022/04/26 (火) 09:32:16 - み 1回異なるタイミングで蛋白抽出して濃度測定したけれど泳動したら全然アプライされている量が違った。 そんな実験で得られたたった１回の結果なんて何も信じられません。 異なる日にやったからなのか、そもそも下手なのか知りませんが、２群で抽出効率が異なっていた可能性もあるし比較的検出しやすい抽出されやすいような類のinternal controlと比較したところで興味蛋白の見積もりが正確にできるか信用できない。 色々検討すべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10420-3 - 2022/04/26 (火) 09:15:04 - qq 可能であれば、１）です。 のせる量をそろえるだけで（本質的に）解決できるのであれば、SDS-PAGEのやり直し（１'？）です。 それだったら、いっそのこと２）の選択かなとも思いますが、ウェスタンの図を説明するのが難しくなる予感。 ところで、二群とは、条件１，条件２であって、タンパク１、タンパク２ではないですよね？

タンパク質抽出 削除/引用 No.10420-1 - 2022/04/26 (火) 05:35:34 - vvv タンパク質抽出についてご意見を聞かせてください。 比較したい２群のたんぱく質を異なるタイミングでタンパク質の抽出しました。たんぱく質の濃度測定がうまくいっていなかったのか、その他なんらかの影響が出たのかわかりませんが、 ２群間のポンソーバンドの濃さが目で見てわかるくらいに違います。 このような場合皆様どうされているでしょうか？ １）再度抽出を同時に行う ２）数値上はハウスキーピングで補正を行うので気にしない ３）論文に乗せるのに、画像を出すのに神経を使うので、なんとかする

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---