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pX458の大腸菌が増えない・・・ トピック削除
No.10426-TOPIC - 2022/04/27 (水) 21:34:54 - pX458
よろしくお願いします。
pX458を海外からもらいました。
ここに自分のsgRNA 20 bpをクローニングし、XL10 Goldに形質転換しました。
ライゲーションのコントロールはsgRNAなしです。

そのコントロールではコロニーゼロで、sgRNAを加えた方では100個以上のコロニーがでました。
サテライトもない綺麗なコロニーでした。
このうち4つをピックアップし、2 ml LB +Ampで37度で一晩培養しましたが、濁りがとても薄かったです。

これをさらに12時間培養してもそこまで増えてなさそうです(今)

pX458ではよくあるトラブルでしょうか?
ご存知でしたら教えてください。
 
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(無題) 削除/引用
No.10426-3 - 2022/04/28 (木) 10:52:42 - G25
pX458は使ったことないですが、oriはpUC系のhigh copyのようですね。

一般的なpUC系ベクターでも、コンストラクトによっては増えが悪いことはあります。おそらく組込んだ遺伝子の毒性によって。
それで足りない分はスケールアップするなり、リッチな培地(例えばTB)にするなりして稼げばいいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.10426-2 - 2022/04/28 (木) 01:49:23 - おお
pX458をそのままTransformationしても増えないですか?

pX458の大腸菌が増えない・・・ 削除/引用
No.10426-1 - 2022/04/27 (水) 21:34:54 - pX458
よろしくお願いします。
pX458を海外からもらいました。
ここに自分のsgRNA 20 bpをクローニングし、XL10 Goldに形質転換しました。
ライゲーションのコントロールはsgRNAなしです。

そのコントロールではコロニーゼロで、sgRNAを加えた方では100個以上のコロニーがでました。
サテライトもない綺麗なコロニーでした。
このうち4つをピックアップし、2 ml LB +Ampで37度で一晩培養しましたが、濁りがとても薄かったです。

これをさらに12時間培養してもそこまで増えてなさそうです(今)

pX458ではよくあるトラブルでしょうか?
ご存知でしたら教えてください。

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