全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.10441-11 - 2022/05/11 (水) 03:57:12 - おお https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269712001054 Tritonx114などを使った方法があります。 Qiagenのプラスミド抽出キットではDEAEカラムに吸着してTrioton X100を含むバッファーでエンドトキシンを洗い流す手法だったと思います。 ６MUrea存在下でNaAcetateを使って沈殿させてもかなり毒性が除けますが、収量とかのぞける量とか検証したことはありません。

その後 削除/引用 No.10441-10 - 2022/05/11 (水) 03:38:16 - きたかみ お世話になります。論文著者に連絡とってみましたが使ってる試薬は我々がこれまで検討してきたのと同じものでした。インサートの塩基配列が異なる複数種のプラスミドを同じロットの前駆脂肪細胞にかけてみたところ同じDNA量でも細胞毒性の出方が異なってきたので、Midiprepの抽出過程でエンドトキシンのコンタミがあるのかもしれません。エンドトキシンがきれいに除去できるプラスミド抽出キットでおすすめございましたら教えてくださいますとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.10441-9 - 2022/05/07 (土) 16:04:33 - きたかみ ＞G25さま 同じキットで同時に調製した空ベクターでも同じように毒性が出ています、トランスフェクション試薬と条件ばかりに囚われていましたがLPSそのコンタミなど精製のステップには目を向けていませんでした。LALでエンドトキシンの混入を検討して精製キットを変えてみようかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.10441-8 - 2022/05/07 (土) 16:01:25 - きたかみ ＞あのさま ありがとうございます。 参考論文の条件を参考にトランスフェクション試薬などは選んでいるのですが、ちょっと連絡を取ってみようかと思います。お返事くれるといいんですが。 導入遺伝子による細胞固有の毒性、確かに。今のところ、空プラスミドでも同様の細胞死が見えているため、条件がバチッと決まったらやってみたいところです。

(無題) 削除/引用 No.10441-7 - 2022/05/06 (金) 14:56:24 - G25 情報からはプラスミドの品質の問題かコンストラクトの中身の問題かに絞られると思いましたので、 QIAGEN Plasmid Plus ならそれなりのグレードですね。ちょっとクラシックではあり、後続製品にもっと良いのはあると思うけど。 検証していないので、そのキットなら絶対大丈夫とも言えないですけどね。 あとは、コントロールとしてGFP マーカだけ発現するような「無害な」コンストラクト（同じ手法でprep)を導入した場合はどうなるか。つまり、問題のコンストラクトの中身の問題か否か

(無題) 削除/引用 No.10441-6 - 2022/05/06 (金) 14:34:04 - あの それからその細胞に、トランスフェクトした先行論文を、詳細に調べたり、 著者にメールで質問してみたらどうですか？ また、その遺伝子による前駆脂肪細胞固有の副作用も検討されたらどうでしょうか？ もしその場合には、成熟脂肪細胞ではどうなるかも、ついでに調べると面白いかも。

(無題) 削除/引用 No.10441-5 - 2022/05/06 (金) 07:23:41 - きたかみ ＞あのさま コメントありがとうございます。2ロット試しており、いずれも同様の結果（細胞死が同程度起こってしまう）になってしまいました。そのため、まずは細胞外の部分に焦点をあてて検討してきました。もう少しロットを試してみる価値はあるかもですね。

(無題) 削除/引用 No.10441-4 - 2022/05/06 (金) 06:45:19 - あの Preadipoの方は、別のロットとか試しましたか？ ほぼ初代細胞に近い細胞の場合には、ロット差というか、個体差というべきか、 大きく違います。

(無題) 削除/引用 No.10441-3 - 2022/05/06 (金) 01:24:09 - きたかみ ＞G25さま コメントありがとうございます。LPS コンタミによる細胞死の可能性があるのでは、ということですね。 プラスミド調製には QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit を用いています。カラムと Buffer ETR を用いたエンドトキシン除去のステップをマニュアル通りに行っています。

(無題) 削除/引用 No.10441-2 - 2022/05/05 (木) 10:04:31 - G25 例えばendotoxinに対する感受性は細胞株によって大きく異なります。あなたの細胞が普段扱っている細胞とは違って感受性が高いとか。adiposeはLPSで炎症反応起こしますしね。 プラスミド精製キットにもいろいろありますがどんなのを使っているんでしょうか。 endotoxin-freeグレードですか？

ヒト前駆脂肪細胞への遺伝子導入 削除/引用 No.10441-1 - 2022/05/05 (木) 02:34:02 - きたかみ ヒトpreadipocyteへの一過性遺伝子導入の条件検討がなかなかうまくいかず、良い試薬あるいは手順の問題がありましたらアドバイスをいただけると嬉しいです。 ベクターには一般的なプラスミドを使っておりHEK293のようにトランスフェクションの容易な細胞ではきちんとワークしているものです。論文や試薬メーカーの情報を参考にpreadipocyteに対してトランスフェクション試薬を種々検討していますが、プラスミドに含まれる蛍光を指標としたtransfection効率はせいぜい20-30%程度でtransfection効率をあげようとするとかなりの細胞死が出てしまいます（遺伝子導入2日後にRNA 量が無処置wellの 1/5-1/10）。遺伝子導入のときの細胞密度は 80% コンフルで、トランスフェクション試薬のみの CTRL では死細胞が出ないので遺伝子導入あるいはプラスミドに起因する細胞死と考えています。導入しているプラスミド自体はキットを用いて精製しており OD260/280、260/230の値は 1.8-2.1 と問題はなさそうでした。 脂肪細胞に対するおすすめの遺伝子導入試薬や手順上のコツなどありましたらアドバイスいただけると幸いです。よろしくおねがいします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---