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RNA-seqをqPCRで確認？ トピック削除
No.10444-TOPIC - 2022/05/06 (金) 18:08:53 - ju
NGSを使ったオミックスアプローチをしたいと考えています。
RNA-seqの結果をqPCRでvalidationするのは必須でしょうか？
慣例的に行われているかもしれませんが、原理を考えればRNA-seqの方がよっぽど正確ではないでしょうか？必須ではないように思えます。
確認しろという人は数十〜数百の発現変動遺伝子を全て確認しているのですか？
　
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No.10444-9 - 2022/05/07 (土) 09:31:42 - 独り言
全部確認する必要はないと思いますが、RNAseqの結果から、一部に着目して解析を進めるはずなので、その一部の遺伝子に関してはｑPCRするのは通常やるべきことでしょう。

それにqPCRで確認するときに、タイムコースとか濃度依存性とか、細かい条件を確認できるわけだし。

(無題) 削除/引用
No.10444-8 - 2022/05/07 (土) 04:21:04 - おお
>RNA-seqの方がよっぽど正確
Sequencingの効率がすべての箇所で１００％であることを示すデーターがない限り正確であるかどうかは判断できないと思います。げんにGCリッチな部分は補正が必要ではないかという議論があるくらいです。

qPCRをするのは全部ではないです。注目する現象に関係するもの、その現象に関わっていれば興味深い仮説を示せるもの、Enrichment Analysisなどで現象などと関連付けられるときに、その代表的で動きが大きいものなど。RNA-seqそのものをValidationするのではないということです。

Validationなしで進めるとしたならば、一つの遺伝子というよりEnrichment Analysisなどを使って結論を出すようなアプローチでしょう。この場合は一つ正確でない遺伝子が含まれていても、あるいは８割がたあっていればこのようなAnalysisは成り立つと思うので。

(無題) 削除/引用
No.10444-7 - 2022/05/07 (土) 02:44:46 - あの
ちなみに、qPCR するならば、そのRNAseq のデータセットの
中にある、たくさんのハウスキーピング遺伝子の中で、
もっとも変動係数が小さいものを、内部コントロールに
すべきなのだろうな、と思ってます。

(無題) 削除/引用
No.10444-6 - 2022/05/07 (土) 02:40:13 - あの
投稿先にもよると思います。

一群あたりN=5以上で、TPMを二群の比較していて、
qPCR無し、タンパク量の測定無しという論文を、最近、
ゲノム系のそこそこ良いジャーナルで見たことがあります。

(無題) 削除/引用
No.10444-5 - 2022/05/06 (金) 22:09:08 - 同業
おっしゃりたいことはわかりますが、どちらが正確かということではなく、independent な実験によって seq の結果を confirm しろ、というニュアンスが強いのではないでしょうか。そのためのスタンダードが qPCRである、と。論文の趣旨によりますが、数十〜数百の遺伝子について confirm するような状況は起きないと思います。何かの結論をつけるために必須の10-20 くらいは要求されても仕方ないと思います。

(無題) 削除/引用
No.10444-4 - 2022/05/06 (金) 20:33:43 - hじ
RNAseqで検出された遺伝子全部を検証しろという人はいないと思いますので安心してください。ただ関心のある遺伝子（注目して以後深く調べる予定の遺伝子、研究の本質的な部分に関わる遺伝子）だけはqPCRとwestern blottingと組織or細胞の免疫染色でもデータを取って確認することは、みなさんされてると思います。もちろん必須かどうかの判断は当事者に任されますが、検証しないと不安ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.10444-3 - 2022/05/06 (金) 20:14:02 - が
"Nobody"は言い過ぎ

(無題) 削除/引用
No.10444-2 - 2022/05/06 (金) 18:16:55 - おお
Nobody believes RNA-seq results without validation.

RNA-seqをqPCRで確認？ 削除/引用
No.10444-1 - 2022/05/06 (金) 18:08:53 - ju
NGSを使ったオミックスアプローチをしたいと考えています。
RNA-seqの結果をqPCRでvalidationするのは必須でしょうか？
慣例的に行われているかもしれませんが、原理を考えればRNA-seqの方がよっぽど正確ではないでしょうか？必須ではないように思えます。
確認しろという人は数十〜数百の発現変動遺伝子を全て確認しているのですか？
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