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(無題) 削除/引用 No.10448-16 - 2022/06/17 (金) 19:49:59 - すん みなさま たった一日でたくさんのコメントをありがとうございました！ なるほど。 やはり遠心は少し強めの方がよさそうですね。 1000xg, 5minでトライしてみたいと思います。 サポニンは未経験でした。 TX-100でうまくいかなかったら試してみたいです。 またご報告します！

(無題) 削除/引用 No.10448-15 - 2022/06/17 (金) 08:54:54 - tent アスピレーターの先に取り付ける８連のアダプターもありますよ

(無題) 削除/引用 No.10448-14 - 2022/06/17 (金) 07:44:05 - Tracker 細胞内染色もV底ウェルでやってます。 ・生細胞は300xg 5minのところ、膜透過処理以後は1000xg, 5 mimに ・膜透過の遠心時には0.5-1%でBSAが入るようにする ・tritonよりもサポニンのほうがロスりにくい という感覚はあります。

(無題) 削除/引用 No.10448-13 - 2022/06/17 (金) 02:39:50 - あほうどり 前レスの追記です． 細胞はhuman PBMCや細胞株， 1*10^5でも十分FACSできますがすこーし少なめな印象です． でもPBMCならP1ゲート10^4は余裕にとれます．（ちょっと時間かかりますが）

(無題) 削除/引用 No.10448-12 - 2022/06/17 (金) 02:35:02 - あほうどり 細胞内染色，デカントすべて 96wellで普段やっています． 例えばFoxP3, IFN-γ，pATMなどです． FoxP3のpermilization kitや，0.1% Tween, Tritonで 普通にできます． 遠心は3分だと少しペレットがゆるいので， 5分で時間をおかずにすぐにスナップをきかせて １度だけ上清除去してください． なんどもやると細胞がなくなります． ご参考までに．

(無題) 削除/引用 No.10448-11 - 2022/06/16 (木) 18:06:57 - すん emaさま 早速ありがとうございます。 やはり細胞内染色時にはプレートは難しいですかね。。 検体数が多くなりそうなので、なるべくチューブの使用を避けたかったのですが、他にどうしようもなさそうならチューブでやるしかなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.10448-10 - 2022/06/16 (木) 18:02:41 - ema 細胞内染色で同様な実験時には私は96穴でやったことは無いです。チューブです。それなりにロスは発生しますが、減るのを見越した細胞数から始めて解析には十分でした。 遠心は生細胞の時より強め（長めに）に回しました。

界面活性剤を入れたら・・・ 削除/引用 No.10448-9 - 2022/06/16 (木) 17:37:56 - すん 一度は解決したかと思ったこの問題ですが、またご相談させてください。 今回、細胞をホルマリン固定後、Triton-X100で可溶化し、細胞内タンパク質の染色を試みたところ、相当な数の細胞が剥がれてしまいました。 界面活性剤が入っているので、デカントの衝撃に耐えきれなくなったのでは、と想像しております。 固定・可溶化して界面活性剤の入った細胞懸濁液をうまくペレットにしてデカントしても剥がれなくするよい方法を御存知の方はいらっしゃいますか？ 何か、RNA調製のときのエタ沈メイトのような効果がある共沈剤があるとよいのですが、細胞の場合にそのようなものがあるかどうか、私には分かりません。 グリセロールなどでそういうこともできるのでしょうか・・・？

(無題) 削除/引用 No.10448-8 - 2022/05/31 (火) 13:08:51 - すん お返事が遅くなり失礼いたしました。 スナップを利かせる方式で、躊躇せずデカントしてみたところ、比較的多くの細胞が残っていました。 プレートはU底です。V底の方がよいのかもしれませんが、手元になくて。 洗った後の細胞数がウェル間で少しバラけましたが、測定に支障があるほどではなく、なんとかなりそうです。 最終的にはこんな感じでした。 細胞濃度: 2x10^6/mL 播種量：1x10^5/50uL/well 洗浄液：5% FBS in PBS(-) 200uL/well 遠心：500rpm, RT, 10min ボルテックス：なし 液切り：勢いよくデカント後、紙にじわっと押し付ける 遠心はひょっとするともう少し短くてもよさそうですが、とりあえずこれでやってみようと思います。 みなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.10448-7 - 2022/05/12 (木) 14:39:23 - -_- 私はU底でした。 平底はいけないのかも。

(無題) 削除/引用 No.10448-6 - 2022/05/12 (木) 12:39:22 - Tracker プレートはV底を使ってますよね？

(無題) 削除/引用 No.10448-5 - 2022/05/11 (水) 20:15:16 - すん emaさま ありがとうございます。 スナップですね。 確かに、剥がれないように気をつけるあまり、勢いが足りなかったかもしれません。 試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10448-4 - 2022/05/11 (水) 15:17:38 - ema 廃液のところで、ゆるやかにひっくり返すとプレート下の方が流れ出しやすく、軽く振るとさらにばらつきが出ると思うので スナップを聞かせて（バケツの水を一気に投げ落として捨てるように）1回だけ流しに向かって捨てるで、出来ます。 それで96wellプレート何枚も処理して800サンプル近くを流し続けたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.10448-3 - 2022/05/11 (水) 15:07:10 - すん ありがとうございました。 とりあえずご教示いただいた方法（に似た方法）でトライしてみました。 結果としては、一部は剥がれず、一部は剥がれてしまい、再現性がありませんでした。 手でひっくり返すところが再現性のなさにつながっているのかもしれません。 もう少し検討してみたいと思います。 引き続き、よい情報をお持ちの方がいらっしゃいましたらぜひご教示ください。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.10448-2 - 2022/05/09 (月) 10:53:51 - -_- 10^6細胞を分注して遠心(1000rpm, 5min)の後、水場でディッシュをひっくり返して軽く振ったとき、wash bufferだけ除かれ、細胞が残ってることが確認できるかどうか。 そういうやり方を習いました。

96ウェルプレートでFACS 削除/引用 No.10448-1 - 2022/05/09 (月) 09:20:36 - すん 96ウェルプレートを用いて、血球系浮遊細胞のFACS用のサンプル調製をしたいと思っています。 スイングローター式のプレート遠心機はあります。 プレート用のボルテックスミキサーもあります。 数が多いので、なるべくアスピレータは使いたくありません。 この場合、サンプルの遠心→デカント→ボルテックス→洗浄液（染色液）分注、という方法でよいのでしょうか？ よいプロトコルをご存知の方、ご助言をお願いいたします。

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