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シーケンス結果のDNA波長が弱すぎる トピック削除
No.10451-TOPIC - 2022/05/10 (火) 15:07:40 - Hitsuji
16SrDNAを目的にシーケンスしています。シーケンスによって得られる波長が弱すぎて信憑性に欠けます。
方法はDNA抽出後PCR反応し電気泳動(この時点ではっきり濃くバンドが出ています)。
その後、マルチスクリーンによるPCR産物を精製しBigDye3.1でのサイクルシーケンス後、Xterminatorでのシーケンスをしています。
何かアドバイスなどありましたら宜しくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.10451-10 - 2022/05/16 (月) 16:47:36 - SYBR master
>[Re:1] Hitsujiさんは書きました :

> その後、マルチスクリーンによるPCR産物を精製し

私が知っているだけで、「マルチスクリーンによるPCR産物」は3種類(シリカカラム系、セファデックスの濾過系、限外濾過系)が有るのですが、どれを使用したんでしょう。いずれにせよ、96 well系で行っているのかもしれませんので、一般的な精製キットではランニングコストが高くつくと思います。

> 16SrDNAを目的にシーケンスしています。シーケンスによって得られる波長が弱すぎて信憑性に欠けます。

シークエンスクロマトが低く出る原因は、
「PCR時のdNTPsの持ち込み」と考えられています。PCR産物の精製手法か、protocolを確認してみてください。

自分的には、「マルチスクリーンによるPCR産物」および「Xterminatorによる精製」は、96 well formatでも非常に高コストに思えます。

(無題) 削除/引用
No.10451-9 - 2022/05/15 (日) 08:06:11 - TK-1
> キットなんか安いんだから、トラブルシューティングに時間を浪費するよりよほどいいと思う。時間は買うもんですよ。

別のスレと間違えました。無視してください。

(無題) 削除/引用
No.10451-8 - 2022/05/14 (土) 10:14:08 - Tk-1
キットなんか安いんだから、トラブルシューティングに時間を浪費するよりよほどいいと思う。時間は買うもんですよ。

(無題) 削除/引用
No.10451-7 - 2022/05/11 (水) 09:55:37 - 海藻
まあ、ご本人からの情報を待ちましょうよ。

(無題) 削除/引用
No.10451-6 - 2022/05/11 (水) 09:48:57 - G25
PCRは阻害されていないようだし、
二次構造による泳動の干渉は「シグナルが弱くなる」という症状とは合わない、
けどね。

(無題) 削除/引用
No.10451-5 - 2022/05/10 (火) 22:12:38 - が
16SrDNAのヘアピン構造がサンガーシーケンスの泳動&PCRを阻害します。
shRNAなどの単純なヘアピンでも通常のサンガーシーケンスでは読みにくいです。
Azentaなどの外注会社は、難解シーケンスにも対応していますし、すごく綺麗なデータを出してくれます。
初回6000円分無料を利用すればタダでできるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.10451-4 - 2022/05/10 (火) 15:48:21 - G25
「波長が弱い」とは理系らしからぬおかしな表現。
波長は長い短い

「(シグナル)強度が低い」
「波高が低い」
or whatever

(無題) 削除/引用
No.10451-3 - 2022/05/10 (火) 15:44:01 - G25
>マルチスクリーンによるPCR産物を精製し
そのあとの、収量は十分でしょか。テンプレート量が妥当であることはなんらかの方法で確認していますか?

私なら、(PCR後のEPは割愛してでも)PCR産物精製後に泳動して、産物の正しさを確認し、マーカーとの比色で量を見積もります。

(無題) 削除/引用
No.10451-2 - 2022/05/10 (火) 15:14:35 - 88
templateが濃すぎるとか

シーケンス結果のDNA波長が弱すぎる 削除/引用
No.10451-1 - 2022/05/10 (火) 15:07:40 - Hitsuji
16SrDNAを目的にシーケンスしています。シーケンスによって得られる波長が弱すぎて信憑性に欠けます。
方法はDNA抽出後PCR反応し電気泳動(この時点ではっきり濃くバンドが出ています)。
その後、マルチスクリーンによるPCR産物を精製しBigDye3.1でのサイクルシーケンス後、Xterminatorでのシーケンスをしています。
何かアドバイスなどありましたら宜しくお願いします。

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