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(無題) 削除/引用 No.10454-8 - 2022/05/12 (木) 12:29:53 - おお 検量線がまっすぐじゃなくったっていいじゃないか。 lsbio.com/resources/devkitfaq cusabio.com/m-225.html pblassaysci.com/technical-resources/importance-elisa-standard-curve AとBの相互作用がそれぞれの濃度に対して直線的かということ、薄めることによる平衡のシフトを考えるとますますわからないわけですが、、、 それを無視したとして、直線と見ていいウインドーがあってその範囲で見ているのなら直線を引けばいいということになると思う。もしかしたら、直線のウインドーからズレていて少し寝てくるところで測っているのかもしれないが、それならその濃度より低いところで測るようにすれば直線のウインドーに入るかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.10454-7 - 2022/05/12 (木) 09:05:23 - PD 皆様、いろいろアドバイスありがとうございます。 この血液製剤をStandardとして用いたELISAの手法は、既報告にあり、著者に詳しいやり方を聞いて、２年前に行った際には全く問題なく直線的なStandardの希釈系列となっていました。２倍希釈すれば大体1/2の吸光度でした。 今回、全く同じ試薬（Lotは違いますが）で同じやり方でやっているにもかかわらず、前回と違うStandardのカーブになっている原因が分からないです。 プレートリーダーも、全く同じ装置で同じ条件でやっています。 希釈のBufferについて、検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.10454-6 - 2022/05/12 (木) 05:52:07 - あの よく状況が理解できないのですが、次も検討されたらどうでしょうか？ 市販のタンパクAのキットとは、サンドイッチ法ですね？ 血液製剤が本当に濃度スタンダードとして使えるのですか？その根拠は何ですか？ 血液製剤や血清を材料にした、抗B抗体によるウエスタンをしても、 シングルバンドがでますか？段階希釈したら、バンドの濃さはどうなりますか？ 既報はありますか？ いつもAとBの結合は、一対一ですか？その場合、どういう方法で調べられていますか？ 抗体Bがウェルに非特異的な吸着しない補償はありますか？ 特にAのためのブロッキングやバッファ組成では、Bが非特異吸着してしまう可能性は無いですか？ たとえば、AとBでは親水性(新油性)は同様ですか？

(無題) 削除/引用 No.10454-5 - 2022/05/11 (水) 14:12:56 - G25 ELISAは酵素反応のエンドポイントで見ているはずで、原理的に標識量とシグナル強度（産物量）は、1/2希釈したら強度1/2になるような比例定数1の正比例になるとは限りません。タンパク質定量が正比例になるのはタンパク質の量が直接反映される着色法だからです。 それは置いておくとして、 ELISAで濃度と強度が直線性が悪くなる要因はいろいろありますが、 まず私が疑うのは希釈をただのバッファーで行っているところです。 スタンダートなりサンプルなりだけを希釈すると、系に含まれる総タンパク質の濃度がガラッとかわります。そうすると、標的の濃度に比例した変化ばかりでなく、含まれる総タンパク質濃度が変化することで相が変わってしまうということも起こります。 例えば、基盤への吸着が薄い濃度では効率よく起こるが、濃度が高いと効率が下がる（ブロッキング効果などで吸着効率が落ちる、飽和により頭打ちになる）など。 ですから希釈液には適当なキャリア（タンパク質の希釈にはBSAなど、核酸の希釈にはサケ精子DNA、酵母tRNA, linear PAなど）を過剰量（希釈されるものの濃度変化が無視できるほど）含むバッファーでやるべき。

(無題) 削除/引用 No.10454-3 - 2022/05/11 (水) 13:58:02 - qq ＞２年前に全く同じ実験をした際は、 とのことなので、プレートリーダの測定条件も見直すとよいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.10454-2 - 2022/05/11 (水) 13:55:01 - qq 何も考えたくなければ、最も簡単な式である、直線を使うことになるでしょう。 簡単な式に対応できるのであれば、曲線でも構いません。 理由が適当にあるのであれば、4パラロジスティック（いわゆるS字状曲線）でも構いません。 imagejのanalyse>tools>curve-fitだと、たくさんの選択肢が出てきます。 指導者に「直線じゃないとダメ！」と言われたなら、直線を使うとよいです。 ＞血清サンプルも1/2希釈しても1/2の値にならないことがわかりました。 操作上の問題を考えてみるべきですし、原理上の問題も考えるべきです。

ELISAの検量線が直線に引けない 削除/引用 No.10454-1 - 2022/05/11 (水) 13:34:53 - PD いつも勉強させてもらっています。 市販のタンパクAのELISA Kitを使用して、ヒト血清のELISAを行っています。 タンパクAとタンパクBの複合体の濃度を測定するため、抗体は別会社のタンパクB抗体を使用し、Standardはヒト血液製剤を希釈して使用しています。 ２年前に全く同じ実験をした際は、ほぼ真っすぐな検量線が引けていて問題なかったのですが、今回別の血液サンプルで測定しようとしたところ、検量線が極端な対数グラフのようになってしまいました。（２倍希釈しても1/2より大きい吸光度になる） 別々の実験者がStandardの希釈系列を作成しても同じようなカーブになります。WB用のタンパク定量でアルブミンの希釈系列を作成すると、２人とも直線になるので、手技的な問題ではないと思われます。 Bufferを作り直したり、血液製剤を購入し直しても、同様の結果になりました。また、Standardだけでなく、血清サンプルも1/2希釈しても1/2の値にならないことがわかりました。ELISA Kitは２種類のLotでそれぞれ試してみましたが、これも同じ結果になっています。 原因がわからず困っています。 何かアドバイスをいただければ助かります。

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