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(無題) 削除/引用 No.10463-23 - 2022/05/19 (木) 06:55:54 - おお >[Re:22] iiiiさんは書きました : > >[Re:21] みさんは書きました : > > 細胞由来のWesternでは1回の実験辺りn1でやるので完全に独立した実験を回数重ねますね。正直実験間の誤差が結構大きくてn3なんかで有意差でることあまりないので5,6回はリピートするようにしています。見た目からして差が出ると感じるデータは絶対に良いデータになるという安心感があるので焦らず空いた時間に繰り返しています。 > うーん。。。。そんなに、やります？何度もやってチャンピオンデータだけ拾ってる、ってことはないですよね？ 定量してグラフを作るという前提で書いているように見えるので、いいところだけ取っているみたいには思えません。また、多重検定が絡むこともあるのでその検出力を考慮すると五回くらいやったほうがいいことも。

(無題) 削除/引用 No.10463-22 - 2022/05/19 (木) 05:42:38 - iiii >[Re:21] みさんは書きました : > 細胞由来のWesternでは1回の実験辺りn1でやるので完全に独立した実験を回数重ねますね。正直実験間の誤差が結構大きくてn3なんかで有意差でることあまりないので5,6回はリピートするようにしています。見た目からして差が出ると感じるデータは絶対に良いデータになるという安心感があるので焦らず空いた時間に繰り返しています。 >[Re:17] みさんは書きました : > 本筋に戻すとwesternなんかは1回あたりn=1でやることが多いです。duplicationとかあまり意味ないと感じています。dupli, tripliでやるくらいなら新たにサンプル調製して再現性を兼ねて差を確認した方がマシかなあ。 > あとwesternは同じサンプルを流してもゲルの端の方と真ん中の方で少し見え方が変わったり、2枚レプリカを作成して同じ抗体で検出しても少し見え方が違ったりしませんか？ > １回調製したサンプルの真偽を確認するために複数回流すことあります。 > 1,2,3,1,2,3 とか1,1,2,2,3,3てな感じで、、、もちろんN=1のカウントです。 うーん。。。。そんなに、やります？何度もやってチャンピオンデータだけ拾ってる、ってことはないですよね？

(無題) 削除/引用 No.10463-21 - 2022/05/18 (水) 17:24:32 - み >[Re:20] ててさんは書きました : > １回の実験のreplicateはnにならないという方は、そもそも1実験回の試験を以て検定をしてはならないということであっていますか？ 細胞由来のWesternでは1回の実験辺りn1でやるので完全に独立した実験を回数重ねますね。正直実験間の誤差が結構大きくてn3なんかで有意差でることあまりないので5,6回はリピートするようにしています。見た目からして差が出ると感じるデータは絶対に良いデータになるという安心感があるので焦らず空いた時間に繰り返しています。n3なんかで差が出るデータってなかなか遭遇しなくて、inductionとかAll or nothingみたいな大きな差だろうし、そもそも定量する必要性を感じないですが。 自分の場合は毎回変動値を論じないといけないデータかというとそうでなくて１論文1,2データくらいの鍵となる部分だけ頑張って定量します。 その他はRepresentative data of X independent experiments.で示しています。リン酸化経路とか上下関係を綺麗に示したり、分子間結合を示したりサポートして全体像を提示する方が重要なので。 > これ本当に皆さん全てのケースにおいて独立した実験でのみ有意差検定するんですか？ > 理想的にはそうすべきである一方で現実問題として試験系によっては相当難易度が高いものがあるかと思いますが 増殖アッセイ、Glo検出系など実験間の誤差が大きい実験はOne representative data of X independent experiments performed in quadruplicate.とかで各回毎に検定できるようにします。Figure legendに記載して文句言われたことはないですが、ウェル間の誤差が小さいと本質で無い差でも有意差ついちゃうことありますが。。。 他の人が指摘されているように独立日に再現できることが重要なので示し方やデータの取り方は色々あるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.10463-20 - 2022/05/18 (水) 15:23:28 - てて 例えば、わたしは1実験回を3well以上で実施し、対照群と薬液群とで検定したうえで有意差が付いた場合、これが再度有意になるかどうかを確認するという意味で再現性試験を実施します。 １回の実験のreplicateはnにならないという方は、そもそも1実験回の試験を以て検定をしてはならないということであっていますか？ これ本当に皆さん全てのケースにおいて独立した実験でのみ有意差検定するんですか？ 理想的にはそうすべきである一方で現実問題として試験系によっては相当難易度が高いものがあるかと思いますが

(無題) 削除/引用 No.10463-19 - 2022/05/18 (水) 13:24:45 - LPS 個人的の感想から意見を述べさせていただくならば、１回きりの実験で、nが例えば膨大な実験よりも、n=1でも、独立した実験を二回繰り返してる方が信用したくなります。 一回の実験では、チューブの取り違いなど、諸々の、単縦なミスの可能性さえ排除できないので。

(無題) 削除/引用 No.10463-18 - 2022/05/18 (水) 11:20:00 - asan こういうのって、要するに嘘や意図的なミスリードはいけないってだけで、絶対こうしなければいけないというのはほとんどの場合において常識的に考えてわかる範囲のことでしかないケースがほとんどでしょう。 N=3を1つのサンプルから3回測定だけしてqPCRをレプリカとするのはバイオロジカルではないとして、じゃあウイルスでステーブル株を作ったKDなりOEなりの細胞株をN=3とする時にわざわざ3回ウイルス作製と感染処理からするかって話を言えば、ほとんどの場合は一旦作製したステーブル株を用いて3回サンプル調整をするか独立した3回のウエルで行うかでしょう。別にウイルスからつくってもだめではないですが、そこまでする本質的に問題はないって思うのが普通だと思います。 ちなみにWBはblotデータしか出さないことが多いのでn=１でOKでPCRはn=3で統計値まで出さなければいけないなんてルールはないので、どちらも原則レプリカに関して議論することはほとんどの雑誌では求められてると思います。しかしWBは再現を取ったところで記載だけで済ましてしまうことがお多いのであまり重視されてこなかったにすぎませんが、最近では定量しろとか、N=1のデータでは特定のfigをさしてだめだと指摘するレビューも増えてます。ま、たくさんあるデータのうち一部のデータがN=1なんてことはよくあるので、こだわりすぎていつまでたっても論文化できないのはどうかと思いますけどね。 結局ビアレビューが全てなので、雑誌の投稿基準を満たすことは重要ですが、グレーなところを律儀やれば価値が認められるというわけでもなくて、重要なのはその論文で議論したい主題を担保する上でクリティカルな情報にかんして再現性を担保できるような実験の組み方ができてるかどうかでしょう。 レプリカの話は統計解析にも関係する話にはなりますが、極端な話実験を3回以上やってうまくいかなかった場合無意識にそれらを条件がいまいちだからって外したりしてるわけで、それだって本当のこというと恣意的な要因にはなります。ただ、根拠があって実験条件を検討している段階のデータを外すこと自体は必ずしも悪いことではありません。何が真実かわからない新しいことをやってる以上、意図する評価とは無関係なところでノイズが生じることなど当然あるからです。行きすぎるとミスリードなどになるでしょうが、その辺はアカデミックはもう研究者個人の職業的使命感や倫理観の範囲でしょう。ルールを細かくしすぎると、できることも限られますから。 一方で、製薬会社の薬剤認可などの基礎データをとる場合などは、そうした認可に必要な実験データやサンプルの由来などについてアカデミアとは比べ物にならないぐらい明確な定義があったりします。パッセージの数とか、クオリティーチェックとか、測定データに人がかなりの面で不当に介入できないような仕組みでやってたりもします。別にn=1のデータでもそれ自体はきちんとしたデータなので、それをどう解釈するかは最終的にはその論文の主題に寄ったりします。N=1オミクスデータでもその後個別解析に価値があればトップジャーナルで論文として成立することもあれば、プロテオームなどの専門誌ではいくらバリデーションで価値のある特定分子等に着目してきちんと解析しても根拠となるオミクスデータがN=1では基準を満たさないからアウト、なんてことも普通にあります。故に、その辺のインパクトと研究主題の中での位置付けを理解した上でどこが肝になるかのバランス感覚も重要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.10463-17 - 2022/05/18 (水) 08:43:27 - み > ＞潤沢なラボだと1日16枚泳動してましたが、 > 1日でそんなに流せますか？若いときや助手が何人かいる場合はいいのかもしれませんが、私は正直パワープレーはおすすめしません。 泳動槽4台(2枚/1台）、Transfer4台あったので1工程8枚いけました。これを1日2回繰り返しただけです。若い頃の話です。リプローブでなくて抗体数種類を同時に検出するときなど結構枚数必要だったので。確かにテクニシャンも居ました。 本筋に戻すとwesternなんかは1回あたりn=1でやることが多いです。duplicationとかあまり意味ないと感じています。dupli, tripliでやるくらいなら新たにサンプル調製して再現性を兼ねて差を確認した方がマシかなあ。 あとwesternは同じサンプルを流してもゲルの端の方と真ん中の方で少し見え方が変わったり、2枚レプリカを作成して同じ抗体で検出しても少し見え方が違ったりしませんか？ １回調製したサンプルの真偽を確認するために複数回流すことあります。 1,2,3,1,2,3 とか1,1,2,2,3,3てな感じで、、、もちろんN=1のカウントです。

(無題) 削除/引用 No.10463-16 - 2022/05/18 (水) 07:48:13 - おお >[Re:15] iiiiさんは書きました : > 正式なルールと言われますと、私も要は「再現性がとれるかどうか」だと思っています。何回以上やらなきゃだめ！ということはないと思います。そういった意味では確認のためにも２回くらいはやったほうがいいかなとも思います。細胞に刺激をかけたらあるたんぱくの発現が増え（減り）ます、と言いたいんですよね。1回しかやってなかったとしてもそう言えればいいと思いますよ。 流石に１回だけなら、レビューアーの時は再現性とれって突っ返すな、よほど事情がない限り。状況証拠が揃っていたとしても所詮そういうデーターから生まれる仮説でしかないから、再現性あるデーターを持って示さないと仮説を証明したとはならない。 しかしながら、二回繰り返して同様の結果だったという記述はたまに見る。論文で肝になる部分は流石にしっかりと少なくとも三回くりかえしてほしいけど（中途半端にやって、偶然出てしまったデーターで発表して、後で捏造だとか疑いかけられたら溜まったもんじゃないから）。 ＞潤沢なラボだと1日16枚泳動してましたが、 1日でそんなに流せますか？若いときや助手が何人かいる場合はいいのかもしれませんが、私は正直パワープレーはおすすめしません。 本人が自分のキャパを把握した上でやる分にはやればいいのかと思います。意外とそんなにということでも、じょじょに数を増やしてなれていけばできていて自分でも「できるじゃん」って後で思うこともありますし。ただ集中力がなくなったりしてデーターにならないような状態になる可能性があるのならやめたほうがいいという指摘はそのとおりだと思います。

(無題) 削除/引用 No.10463-15 - 2022/05/18 (水) 04:41:16 - iiii 正式なルールと言われますと、私も要は「再現性がとれるかどうか」だと思っています。何回以上やらなきゃだめ！ということはないと思います。そういった意味では確認のためにも２回くらいはやったほうがいいかなとも思います。細胞に刺激をかけたらあるたんぱくの発現が増え（減り）ます、と言いたいんですよね。1回しかやってなかったとしてもそう言えればいいと思いますよ。ただその場合は他のアッセイもしてその現象の裏付け的なデータもあったほうがいいですよね。あなたの実験目的は実験を何回かすることではなくて、細胞に刺激をかけることでこういう現象がおきます、ということの証明（説明）をすることですから。 ＞潤沢なラボだと1日16枚泳動してましたが、 1日でそんなに流せますか？若いときや助手が何人かいる場合はいいのかもしれませんが、私は正直パワープレーはおすすめしません。疲れて集中が切れてミスをするおそれがあるためです。失敗したらやりなおしですし、失敗してなくても「ちゃんとできてたかな？」と不安になって再実験したくなるからです。 ＞現実問題、前任者のデータの再現性が取れずに、取れないどころか簡単に否定できる実験データで皆さん論文だされていて、実験テーマの根本を軌道修正してから研究を開始しないといけないことを何度も経験しています。 ままありますよね。これが本当に困ります。

(無題) 削除/引用 No.10463-14 - 2022/05/18 (水) 03:58:55 - おお > (１回が4well × 3 × 2) × 3回 繰り返しの部分がありますが、 一回の実験で１Wellでも言い訳で、とくにWBで３Well取ることは私の感覚ではないです。WBなら１Wellにしてます。１回の実験で使うWellはテクニカルにどれくらいブレるのかを念頭に入れて決めればいいと思いますが、やったことのない（どれくらいブレるかわからない）実験では３Wells（すくなくとも２）とって置くほうが無難です。

(無題) 削除/引用 No.10463-13 - 2022/05/18 (水) 02:41:40 - み >[Re:11] pさんは書きました : > (１回が4well × 3 × 2) × 3回・・・・こんなにウェスタンやらPCRやらするものなのでしょうか！？ 1回の実験を24 well plateたった1枚でできて、SDS-PAGEたったの2枚ですか。普通にやりますよね？ 動物組織は細胞なんかより個体差や抽出効率がブレたりでもっと大変ですよね？ 昔の科研費若手Bや基盤Cで細々とやっていますが、バッファーやゲルは全部自作で節約です。 やりたくても金がなくてわざと実験スピード落とさないといけなかったり情けない限りです。 潤沢なラボだと1日16枚泳動してましたが、やはり自作です。プレキャストに金使うくらいなら他の部分に投資します。 別日に何回もリピートしなくてよく信じられるなあと思います。 現実問題、前任者のデータの再現性が取れずに、取れないどころか簡単に否定できる実験データで皆さん論文だされていて、実験テーマの根本を軌道修正してから研究を開始しないといけないことを何度も経験しています。 まあ大抵博士論文を大嘘で書いてくれているのですが。 qPCRは金がかかる割に所詮メッセージレベルなので重要な部分の押さえのため実験にしかやりません。

(無題) 削除/引用 No.10463-12 - 2022/05/18 (水) 00:03:30 - おお >[Re:10] みさんは書きました : > 複数Wellでやろうがn=1と考えている。テクニカルエラーを排除しているに過ぎない。 そうですよね。実験的誤差を最小限にするためWellを増やしているだけで、そういう意味ではTechnical replicatesだと私も思います。 >[Re:11] pさんは書きました : > ＞No.10463-10 > 異なる日に3回同じ実験をすれば自然と継代数の異なる細胞で再現できることが確認可能。 > > 項目数によりますが、ウェスタンにしろ、リアルタイムPCRにしろ、ものすごくお金がかかりますね。 > > たとえばですが・・・・ > > 刺激４項目で、インヒビターあり/なし　だとすると、 > > (１回が4well × 3 × 2) × 3回・・・・こんなにウェスタンやらPCRやらするものなのでしょうか！？ 基本Yesですが、肝は再現性が取れることです。そういう意味ではここにやり方を公開してくださった人たちのコメントが参考になります。条件検討などを１Wellでやって、その積み重ねでIndependentな実験を確保し再現性を確認するとか。 qPCRのRunning コストは実感が無いですが、Westernとか何から何までメーカーが出している試薬やゲルを使っているとたしかに金がかかりますが、Running bufferやGelとか自前で作れますしコストをカットできるところはないですか？

(無題) 削除/引用 No.10463-11 - 2022/05/17 (火) 23:44:11 - p ＞No.10463-10 異なる日に3回同じ実験をすれば自然と継代数の異なる細胞で再現できることが確認可能。 項目数によりますが、ウェスタンにしろ、リアルタイムPCRにしろ、ものすごくお金がかかりますね。 たとえばですが・・・・ 刺激４項目で、インヒビターあり/なし　だとすると、 (１回が4well × 3 × 2) × 3回・・・・こんなにウェスタンやらPCRやらするものなのでしょうか！？

(無題) 削除/引用 No.10463-10 - 2022/05/17 (火) 20:05:19 - み 複数Wellでやろうがn=1と考えている。テクニカルエラーを排除しているに過ぎない。 異なる日に3回同じ実験をすれば自然と継代数の異なる細胞で再現できることが確認可能。 Primary cultureを考えるとやはり異なる日に別個体から調製した細胞を使用しないと再現性が確認できない。

(無題) 削除/引用 No.10463-9 - 2022/05/17 (火) 19:15:49 - てて 本来の意味のn=3は完全なindependentな試験を3回しなければならないと理解しつつ、大抵単一の回の3wellの試験をn=3としてグラフ描いちゃってる気がします。 これは先に書かれてる通りBiological Replicatesとかそういうのに当たったりするのかもしれませんがまぁ明記しておけばいいかなと... 予備検討で同じような結果を示すことは確認しますので、完全にindependentな実験で再現性があることを確認している、くらいのことは書くとは思いますが、それを3回以上やった上でグラフにして統計解析はあまりしないですね...良くない研究者なのかもしれません みなさん3回ずつやるんですかねぇ...その場合の統計処理って3wellずつの試験だとすると各回のtriplicateのaverageに対して処理したりするんでしょうか 流石の私も1つのwellの細胞から得られたmRNAを3wellに分けてqPCRしたからn=3だ！みたいな主張を見た時は頭が痛かったですが...

(無題) 削除/引用 No.10463-8 - 2022/05/17 (火) 16:44:00 - ぼっち研究員 何がスタンダードなのか知りませんが、私もごんべえさんみたいな感じです。 １）予備検討 条件１、条件２、条件３,・・・・ ２）リファイン＆再現実験 条件２が最適だったとして、 条件2-1, 条件2-2, 条件2-3, ・・・・ ３）論文用のデータ取り 条件2-2が最適だったとして 条件2-2を３回（3 dishes） 1), 2), 3)を行う過程で時間経過や環境変化もあり、この実験が再現性のあるものだと自信が持てます。 てか、自分がびっくりしたのは試料の処理＆調製を１回しかしなくて、測定を３回してn=3として発表している人がいたことですわ。

(無題) 削除/引用 No.10463-7 - 2022/05/17 (火) 13:04:52 - ごんべえ 私は下記です。 1)条件検討（n=1）x様々な条件で複数回 ↓ 2)3wellでのbiological replicate 上記方法であれば、細胞がたまたまおかしくなった可能性も極力排除できるし、実験自体も再現は取れているし、データとしても統計処理ができるかなと。何もn=3を複数回繰り返す必要はないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10463-6 - 2022/05/17 (火) 12:50:48 - おお >３つのウェルに蒔くのはbiological replicatesのことで、これはnとして認められることが普通です。 biological replicatesやTechnical replicatesはものの見方によって変わる可能性があるので、あまり使いたくない表現ですが（と言いながらよく使われる言葉なのでつい使ってしまう）、３wells 使ったからと言って独立した実験でなく、再現性を示すことにはならないと思うのですが、３wells つかえば一回の実験でデーターを出して投稿している人もいるのでしょうか。みんなどうしているのか気になってきました。

(無題) 削除/引用 No.10463-5 - 2022/05/17 (火) 09:42:13 - toto ３つのウェルに蒔くのはbiological replicatesのことで、これはnとして認められることが普通です。例えば、JBCの投稿規定はこちらで、 ://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data nをそのように用いるならば、biological replicatesであることを明記するようにとあります。ここではtechnical replicatesも、nとして書いてもいいとはあります。ただ、technical replicatesは普通は操作誤差になるので、書いてよくてもだめといわれることが多いと思います。 ただ、reviewerによってはbiological replicatesもダメといわれることもあります。ともかく先輩か先生に聞きましょう。

(無題) 削除/引用 No.10463-4 - 2022/05/17 (火) 02:41:08 - おお あ、補足ですがNo.10463-2のようなやり方をするときは最初から３つのデーターを何がしかの方法で示しておくほうがいいです。

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