BioTechnicalフォーラム [ナイーブマクロファージ(M0)のマーカーについて]

ナイーブマクロファージ(M0)のマーカーについて

No.10485-TOPIC - 2022/05/23 (月) 16:48:40 - あひる

マクロファージの分極に関する研究をしており、vitroで、単球(THP-1細胞)をマクロファージにPMAで分極させ、その後の培養条件でM1もしくはM2への分極率を評価したいです。
M1、M2に関するマーカーは、先行研究が多く、選定できています。
一方で、M0のマーカー(M0からどれぐらいの割合がM1/M2に分極したかを知るために、M0の割合も評価したい)に関しては、ほとんど文献が見つからず、困っています。
M0のマーカーとして使えるもの、評価方法等あれば、教えていただけると有り難いです。参考文献もあると、より大変ありがたいです。
どうぞよろしくお願いします。
　

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No.10485-4 - 2022/05/25 (水) 00:24:47 - あふ

>>例えばM0 100のうち、M2へ5分極させました、だとインパクトが弱く、M0 100のうち、より高い率(ex. 80-90%)でM2へ分極できていることが望ましい

私は、これを評価するときには、残ったM0を評価するのではなくて、Arginase-1とiNOSをWBやqPCRで定量していました。極性を変化する生理活性物質の濃度を振って実験したときだっと思います*1。”当たり”の物質だったときは、1、10、100 ng/mLで振って、添加量が多くなるに従ってArginase-1のWBのバンドも強く出たと記憶しています。
他にも、培養液中のNOを測定する方法があったと思います。亜硫酸量を測定するものだった気がします（こちらはM1の評価ですね）。

M0評価の手っ取り早いのはCD11bなどのマクロファージならなんでも染まるようなものと、M1orM2に固有なもので染めて、CD11b+固有マーカ+/CD11b+固有マーカ-の割合を計算する、とかでしょうか？　*2
CD11bはTHP-1 derived macrophageで陽性を示しますし、M1/M2の固有マーカーに関しては選定できているとのことですので、この方法はいかがでしょうか？

*1 手元に当時の実験ノートがないため、記憶頼りで申し訳ありません
*2 例えば、CD206をM2固有マーカとして、CD11b+CD206+ / CD11b+ CD206- の割合を計算します

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No.10485-3 - 2022/05/24 (火) 22:11:21 - あひる

早速にご回答いただきありがとうございます。
非常に近しい研究例から、ご意見いただき大変参考になります。

参考文献いただいたよう、CDマーカーの中で、意図したものを選び、FACSで陽性率を見れれば有難いです。
もしくは、その他マーカーを決めて、qPCRやELISAで測定できればと考えています。

＞M0の割合を評価したいとのことですが、何に対する割合を評価したいですか？THP-1細胞のうち、どれくらいがM0になったかを評価したいということですか？

M0の割合を評価したい意図としては、
① THP-1細胞のうち、どれくらいがM0になったかを評価
② M0細胞（PMA添加して培養したTHP-1：ここでは100%がTHP-1→M0になっていると仮定）を、M1/M2細胞に分極させた（ここの分極方法が研究テーマです）際、残っているM0細胞の割合を評価

①②どちらのM0も評価できると良いですが、特に②を評価したいです。

その理由は、新しい方法でM1/M2分極の割合を増やしました、と主張した際に、
最初のM0を100とした場合に、どれほどの割合がM1/M2になったのか、を検証したいです。
（例えばM0 100のうち、M2へ5分極させました、だとインパクトが弱く、
　M0 100のうち、より高い率(ex. 80-90%)でM2へ分極できていることが望ましい）

アドバイスいただけるとありがたいです、よろしくお願いします。

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No.10485-2 - 2022/05/23 (月) 22:04:56 - あふ

偶然ですね、私もちょうどその実験に取り組んでいます。しかし、私もマクロファージが専門というわけではないので、よりお詳しい方からの批判的なレビューを歓迎します。

THP-1 derived macrophageの評価ということですが、私はPMAを添加したRPMIで培養し、接着した時点でOKと考えています。私は、都度の実験で接着率を測定して、一定以上であれば、下流の実験に進むというクオリティコントロールに利用しています*1。

あと、これは私の実験系に特徴的なものなので利用できるかはわかりませんが、下記参考文献のFig 6でMonocyteで白、Macrophageで赤になっているとあるCDマーカー*2を使って、FACSで陽性率もみています。ただし、これはマクロファージをプレートから引っ剥がすときにダメージを受けるため、生存率などの評価には使いにくいです*3。

M0の割合を評価したいとのことですが、何に対する割合を評価したいですか？THP-1細胞のうち、どれくらいがM0になったかを評価したいということですか？

（参考文献）
Application Note Flow Cytometry and High-Content Imaging to Identify Markers of Monocyte-Macrophage Differentiation

https://www.semanticscholar.org/paper/Application-Note-Flow-Cytometry-and-High-Content-to-Mittar-Paramban/b14f6606dd81c392e6ce9fcc6a100c86cc18da82

*1 共同利用の冷蔵庫を長時間開放する人がいて、だいぶコンプレッサが弱っており庫内の温度が安定せず、PMAが失活していないか不安なため
*2 申し訳ない、伏せさせてください
*3 冷却PBSとon iceを組み合わせて穏やかに引っ剥がしても細胞がいくらか死んでしまいます。完全にこれを避けるためには「温度感受性培養皿」を使用するとうまくいきます。

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No.10485-1 - 2022/05/23 (月) 16:48:40 - あひる

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