お世話になります。
いつも参考にさせていただいております。
私は医学系大学院に所属する院生です。
マウスのリンパ球のsortingをFACS Aria IIで行う実験を開始した初心者です。
最終的な目標は、特異的なCD8をsortingしてRNA seqなど網羅的な解析に持ち込むことです。
周囲に経験の有る者がおらず、皆様にご教授いただけたら幸いです。
予備実験としてマウス脾臓のCD8 T cellをsortingしたのですが、sorting後のsampleをAria IIで解析したところFSC-SSCで設定したリンパ球gateとは全く異なるエリアに大量の細胞集団を認めました。
sorting gateとしてはリンパ球>doublet 除去>死細胞除去>CD8としています。
おそらくsortingの過程で死亡した細胞集団ではないかと考えているのですが、この問題を解決するために工夫できること・注意すべきことなどはどのようなことになるのでしょうか？（sorting gate作成時のFCMではそのような死細胞を疑う集団は認めておらずsorting前のsample調整は問題ないものと解釈しており、sorting によって死亡した？のではないかと考えています。）
以下、sorting時の条件になります。
・nozzle 100μm
・sample濃度 5e6 cells/mL
・回収チューブ 5mlポリプロピレン製チューブ
・回収Medium RPMI(10% FBS)（あらかじめ3mlほど回収チューブに入れている）
・回収チューブ冷却 LAUDA 3℃
・Flow rate (2.5-3.0)
・回収総時間 5時間（15分ごとに回収チューブを取り替え、回収したsampleは氷冷）
皆様のご意見をいただけますとありがたいです。
よろしくお願いいたします。 |
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