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(無題) 削除/引用 No.1052-14 - 2012/10/30 (火) 17:19:15 - バブリー 皆様、貴重なご意見ありがとうございます。 使用しているのは炭酸バッファーです。グリセロールは入れていませんでした。 今日Bradford法でタンパク濃度を測定しなおしてみたのですが、やはり同じでタンパク濃度は低値でした。 簡易的な280nm吸光度でのタンパク濃度測定でも、高い値が出ているときにはELISAのOD値も予想通りとなり、低い値が出ているときには失敗していることから、やはりタンパク濃度は減少しているのではと考えています。 チューブ吸着の可能性について検討してみたいと思います。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.1052-13 - 2012/10/29 (月) 15:06:26 - おお 追加情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1052-12 - 2012/10/29 (月) 13:17:53 - anshin おおさん： すいません。濃度は覚えていません。1mg/mLよりは低かったとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1052-11 - 2012/10/29 (月) 12:04:01 - ~ 追加です。凍結方法は不明です。チューブはエッペン純正1.5mlチューブかどこかの会社のスチレン製15mlチューブです。（彼女がどちらを使ったかは分かりません） そういえばスチレンには吸着作用が。。。

(無題) 削除/引用 No.1052-10 - 2012/10/29 (月) 11:59:09 - ~ 濃度不明です。正直言うと私は凍結が原因ではないと考えています。 （解凍後の攪拌が不十分で薄い部分を取ったとか） あと、GST融合タンパクではなく、ラット脳から取ったタンパク抽出液です。

凍結方法は？ 削除/引用 No.1052-9 - 2012/10/29 (月) 10:53:20 - aji 凍結融解でタンパク質が吸着した経験、感触のある方にお聞きしたいのですが、凍結は液体窒素で行っているのでしょうか。 液体窒素で凍結したら凍結融解一回ぐらいでの問題はほとんどないという感触を持っていますので（実際には凝集するケースも経験しています）凍結方法も明記してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1052-8 - 2012/10/29 (月) 10:52:52 - おお >[Re:7] ~さんは書きました : >[Re:6] anshinさんは書きました : ~さん、anshinさん有用な情報ありがとうございます(とぴ主ではないのですが)。後学のためもし思い出せるようでしたらそのタンパクのチューブに保存した時の濃度を教えていただきませんか?

(無題) 削除/引用 No.1052-7 - 2012/10/29 (月) 10:30:34 - ~ 自分のことではないので詳細は分からないのですが、ラボの同僚が同様のことを言っていました。チューブをソニックしたら解決したそうで、それ以来彼女は解凍したサンプルを必ずソニックするようになりました。

GST-fusionではないですが 削除/引用 No.1052-6 - 2012/10/29 (月) 09:24:45 - anshin GST-fusionではありませんが、以前、凍結融解後に、溶液中の蛋白質がほぼゼロになった経験があります。その時は、低吸着チューブで回避できました（KENさんの言われる「妙なチューブ」だったのか、それとも「妙な蛋白質」だったのかわかりませんけど）。溶液を全て除いた後、SDS-PAGEのサンプルバッファーを入れて、チューブをボイルして電気泳動すると、チューブのほうに、てんこ盛りにバンドが見えたので、その時はチューブ吸着としました。この方法で確認できませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1052-5 - 2012/10/29 (月) 07:05:40 - おお わたしもチーブの吸着でロスが目立つようなタンパク濃度とは思えませんが、、、

(無題) 削除/引用 No.1052-4 - 2012/10/29 (月) 05:03:30 - KEN 1回の凍結でそんなに減った経験は、私にはありません。 本当に、蛋白に何か起きているのか？私は疑問です。(むしろ測定上の問題の気がします。) 僕もバッファーの影響で正確な吸光度が測れていないだけの気がします。 280nm紫外吸収法でのタンパク質測定は、あんまりあてにならないので、私はあまり使いません。 バッファーは何を使ったのですか？ 界面活性剤が入っているならば、BCA法で測りなおしてみればどうでしょうか？ 凍結時は、グリセロール等入れられていたのでしょうか？ 実際に以前測定に使ったサンプルと同条件で、今回の凍結融解後のサンプルを用いてELISAするとか。。。 あと、思いつくのは、バッファー交換ですかね。。。 チューブへの吸着にしては異常な量ですが、チューブは、低吸着のコーティングされたものでしょうか？(よほど妙なチューブならそんなことも起こるのかもしれませんが、経験ありません。。。)

(無題) 削除/引用 No.1052-3 - 2012/10/28 (日) 12:59:48 - おの 次の順番の可能性は無いですか？ 凍結融解、タンパクの立体構造の変化、抗体との親和性低下、算出される濃度の低下

(無題) 削除/引用 No.1052-2 - 2012/10/24 (水) 16:58:16 - おお 沈殿してませんか? あるいはTRITON X100、NPー40などの界面活性剤のUVの吸収の影響でちゃんとはかれてないとか。DTTが入っていれば酸化されると280nmあたりの吸収はあがりますが、、、バッファーの酸化が進んいれば見積が下がりますよね、、、 決定的なトラブルシューティングになってませんけど、、、

GSTタンパクの吸着 削除/引用 No.1052-1 - 2012/10/24 (水) 16:30:52 - バブリー 教えてください。 GST融合タンパクを作成し、ELISAの抗原として使用しています。 しかし、一度の凍結融解でタンパク濃度が1/100程度に減少してしまいました。（2500μg/ml→300μg/ml） タンパクが分解しても吸光度には変化はないと思われるので、タンパクが吸着されているのではと考えていますが、それにしても大幅な濃度の減少なので、驚いています。 どなたか同じような経験をされた方、対策など教えていただけないでしょうか。 ちなみにタンパク濃度は簡易的ですが、吸光度280nmで測定しています。

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