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細胞の蛍光観察(固定) トピック削除
No.10525-TOPIC - 2022/06/08 (水) 10:45:40 - 蛍光
いつもありがとうございます

細胞の観察に関するご質問ですが
がん細胞をメタエタ固定or 4%PFA固定して染色したいと思っています。

その場合、プラスチック製のシャーレや6well等を用いても問題ないのでしょうか?
材質等を選んだ方がいいでしょうか

知ってる方いれば教えてください
 
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No.10525-11 - 2022/06/14 (火) 04:41:39 - おお
たしかに自家蛍光がじゃまになる可能性など指摘されているようにありますね。要するに通常の培養用Dish/Plateで生細胞で発現確認を蛍光たんぱく質でチェックするぐらいの強度なら使えるかもという話になりますかね。ま、カバーグラスをPlateに沈めるのがベストに近いかと思います。

(無題) 削除/引用
No.10525-10 - 2022/06/14 (火) 03:22:31 - あふ
☆プラ皿でやる場合
底面の厚さのせいで、高倍率の観察ができないことがある。一枚無駄にしていいなら、細胞培養面にマジックで文字を書いて、それにピントが合わせられるかを顕微鏡で事前に確認するという方法もある。
固定液によっては、プラスチックが傷む場合もある。有機化学にあまり詳しくないので、メカニズムはよくわからないが、プラスチックが溶けたり、変な臭いがしたりするらしい。しかし、最近のプラスチック培養皿で、これが問題になることは殆どない気がする。プラ皿が変になるまで固定したら、それはもはや過固定な印象もある。
自家蛍光も問題になりがち。こればっかりは実際に顕微鏡に載せて観察しないことにはわからない(事前に知る方法がない)。

☆側壁(フチ)をバリバリ壊す場合
この方法も手軽で良い。好きなカバーガラスを使えるし、カバーガラスの滅菌も不要。しかし、壊すときに気をつけないと底面が割れたり、底面が歪んだ拍子に細胞形態が狂ったりする。昔やったときは、通電させたニクロム線で丸いディッシュの中心部分を四角く切り出した覚えがある。

☆プラ皿にカバーガラスを沈める方法
細胞とガラスの接着性が問題になる。事前にカバーガラスを洗浄して、オートクレーブにかける必要がある。洗浄はただの洗剤で良いという人もいれば、王水で洗えとか、気合を入れてホウ酸バッファーで洗えとか、人によっていろいろな流派がある。いずれにせよ、その細胞が接着するかどうかがカギ。カバーガラスを取り扱うときのピンセットと、18Gの注射針の先端を曲げたものがあると便利。

☆専用ディッシュ
顕微鏡で観察することが前提になっている製品も最近は増えてきている。自分の条件では、ibidiが一番良い結果が出た。いろいろな大きさやウェルがあって重宝する。スーパーハイレゾリューションはダメだったが、共焦点レーザー顕微鏡であれば十分な像が得られた。レンズの設計によっては駄目かもしれないので、事前に顕微鏡の担当者に「使用例ありますか?」と聞いておくのが良いと思う。

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No.10525-9 - 2022/06/12 (日) 13:03:13 - 蛍光
ありがとうございます。とりあえず教えていただいたいろいろ試してみます!

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No.10525-8 - 2022/06/09 (木) 12:54:12 - mont
染色と言っても色々ありますし、観察する倍率や顕微鏡の種類(正立か倒立かなど)、またシャーレなどを顕微鏡に固定するアダプターの種類によって、観察に使える形や材質が変わってきます。

プラスチック製のシャーレや6wellでも問題ないかもしれませんし、問題あるかもしれません。固定液の問題より、最終的にお持ちの顕微鏡で観察できるかどうかの方が問題になると思います。

プラスチック製のシャーレや6wellを使う場合は、通常は対物レンズが下に位置する倒立方の顕微鏡を使い、シャーレの底から細胞を観察することになります。この場合、プラスチックの厚みが邪魔をして(焦点が合わせられない)ので、高倍率(x63、x100とか)での観察は出来ないでしょう。

正立型の顕微鏡を使う予定でしたら、対物レンズを動かすときに、シャーレの壁が邪魔をして対物レンズを正しい位置にセットできない可能性が高いので、事前に確かめたほうが良いです(特に6wellの場合)。
カバーグラスを乗せ、シャーレの壁をペンチなどで取り除いて観察することも可能といえば可能ですが、サンプルが沢山あると大変です。

カバーグラスが顕微鏡観察の際に使われる一番の理由は、「薄さ」です。高倍率になるほど焦点距離が短くなり、プラスチック製品だと焦点が合わせられなくなってしまいます。カバーグラス上に細胞を培養するか、またはプラスチック上に培養して上からカバーグラスを乗せるか。どちらでも構わないのですが、対物レンズがカバーグラスの側に来るようすれば、より高倍率で観察できるということです。

カバーグラス、スライドグラス上に細胞を培養する場合は、細胞の接着性が悪い場合が多いので、表面を何かでコーティングした方が良いでしょう。
また、カバーグラスの厚さも顕微鏡観察に影響します。特に高倍率で観察したい場合、共焦点レーザー蛍光顕微鏡は通常と異なる厚さのカバーグラスが推奨されるので、注意してください。

(無題) 削除/引用
No.10525-7 - 2022/06/08 (水) 21:04:27 - ema
https://www.cscrie-jp.com/contents/pdms_sheet/
カスタムで色々なwellのを作ってくれる

(無題) 削除/引用
No.10525-6 - 2022/06/08 (水) 16:37:37 - a
たいした手間ではないので、とりあえず自分でやってみればよいのでは?

他人の意見通りじゃないかもしれませんよ

ここでダメと言われた方法は何があっても絶対に試さない・・・なんてことないよねぇ

さいきんこの類の質問を見る気がする

(無題) 削除/引用
No.10525-5 - 2022/06/08 (水) 14:00:21 - G25
https://goryochemical.com/faq/
Q. 蛍光顕微鏡観察にどのようなディッシュ・プレート・容器を用いれば良いですか?

(無題) 削除/引用
No.10525-4 - 2022/06/08 (水) 11:30:46 - 774
自家蛍光が弱くて、固定によって剥離しない素材であると確認出来たら使っても良いんじゃないですか。
大概、自家蛍光が邪魔になるのでガラスを使用します。
ガラスボトムディッシュは高価なので、6ウェルプレートや35mmディッシュにコーティングしたカバーガラスを沈めてやっていました。
チャンバースライドは便利ですね。
1枚当たりの価格は高く見えますが、複数のウェルがある、入数の少ないパッケージで売っているという点でガラスボトムディッシュより買いやすいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.10525-3 - 2022/06/08 (水) 11:29:29 - おお
染色って免疫蛍光染色ですよね。
条件は使うつもりの顕微鏡に無理なくセットできるなら観察できます。
3.5cm Dishで固定したあと壁の部分をバリバリ壊して平らにして観察している人がいたなぁ。

でも細胞内の微細な構造とかまで見るとかなるとどうなんだろう。。。

(無題) 削除/引用
No.10525-2 - 2022/06/08 (水) 11:09:19 - r
プラスチック器材でもできないことはないですが、しばしば強い自家蛍光を呈して高いバックグラウンドの原因になるので、ガラス器材の方が良いと思います。それで培養細胞の蛍光免疫染色用には、チャンバースライドやカバースリップなどが便利で汎用されていますので検討ください。いろいろな会社から販売されています。アマゾンとかでも売ってます。
難点はプラスチック器材と比べて接着するまでにやや時間がかかることですが、一旦接着してしまえば大丈夫です。

細胞の蛍光観察(固定) 削除/引用
No.10525-1 - 2022/06/08 (水) 10:45:40 - 蛍光
いつもありがとうございます

細胞の観察に関するご質問ですが
がん細胞をメタエタ固定or 4%PFA固定して染色したいと思っています。

その場合、プラスチック製のシャーレや6well等を用いても問題ないのでしょうか?
材質等を選んだ方がいいでしょうか

知ってる方いれば教えてください

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