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WB以外のCRISPR/Cas9のKO確認方法について トピック削除
No.10537-TOPIC - 2022/06/11 (土) 08:10:30 - 基礎研究初心者
 CRISPR/Cas9によりある分子(非分泌タンパク)のKO細胞を作成しているのですが、うまくワークする抗体がなく、ウエスタンブロットでKO出来ているかどうか確認できていません。タンパクレベル以外で、KOを確認する方法はどのようなものがあるのでしょうか。基本的な質問で申し訳ありませんが、教えてください。
 
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No.10537-4 - 2022/06/13 (月) 15:48:41 - おお
あ、たんぱくレベルという話でしたよね。直接的なら先に言及した、免疫組織染色。またはELISA。ELISAは動物から少量血液採取して、抗体価をチェックするときに使われるので、ELISAに引っかからない抗体は理屈の上では回収対象にはならない。

WBでうまくワークする抗体がないというのは、そういうことも出くわすことこたしかにあります。それでもIP-WBを二種類の抗体でやればノンスペシグナルを極力抑えれる可能性があるのでやってみてもいいのかもしれません。

あとは活性などでしょうけど、特異性、アッセイ系でバリエーションがありすぎるので、書きようがないですが、、、。

それでも一つ書くとしたら、そのタンパクを含むコンプレックスがBNPAGEとかで検出できるなら、そのコンプレックスないのどれかのたんぱくの抗体でコンプレックスのサイズなどを確認するというのもできなくはないでしょう(間接的ではありますが)。

それか、MSに持ち込みます?あまり現実的ではないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用
No.10537-3 - 2022/06/13 (月) 11:14:25 - ぴ
そのタンパク質の既知の機能が欠失しているか確認する

(無題) 削除/引用
No.10537-2 - 2022/06/11 (土) 09:01:21 - おお
潰したところの配列を確認すればどうでしょうか。

免疫組織染色でワークする抗体があれば染色してみてもいいかもしれませんけど。

WB以外のCRISPR/Cas9のKO確認方法について 削除/引用
No.10537-1 - 2022/06/11 (土) 08:10:30 - 基礎研究初心者
 CRISPR/Cas9によりある分子(非分泌タンパク)のKO細胞を作成しているのですが、うまくワークする抗体がなく、ウエスタンブロットでKO出来ているかどうか確認できていません。タンパクレベル以外で、KOを確認する方法はどのようなものがあるのでしょうか。基本的な質問で申し訳ありませんが、教えてください。

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