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(無題) 削除/引用 No.10550-3 - 2022/06/17 (金) 00:12:48 - ema zsxctvgyさん、 ご提案ありがとうございます。 このサンプルはRIPAで破砕後凍結していました。 SDS-PAGE前にサンプルバッファーを加えるプロトコールにしています。 言われていますように長期保存中に酸化や分解が起こって今回の問題が起こっていると考えられます。 ありがとうございます。 >[Re:2] zsxctvgyさんは書きました : > その古いサンプルにメルカプトエタノールあるいはその代替品をサンプル量の1/20量ほどあたらに加えて室温で1時間程度置いてから泳動してみてください。(このとき加熱は不要です)。 > 改善すると思います。（当初加えた分のメルカプトエタノールは無視していいです） > > SDS sampleであっても-20℃保存だと酸化や分解など長期保存中にいろいろおこるようです。特に凍結融解を反復しているとその傾向は顕著になります。なので基本的にはこうしたサンプルでも-80℃保存にし、今後も何度か使用する予定のある重要なサンプルの場合は面倒ですが適宜分注するなどして凍結融解の反復は極力避けるようにしましょう。 >

(無題) 削除/引用 No.10550-2 - 2022/06/16 (木) 11:28:26 - zsxctvgy その古いサンプルにメルカプトエタノールあるいはその代替品をサンプル量の1/20量ほどあたらに加えて室温で1時間程度置いてから泳動してみてください。(このとき加熱は不要です)。 改善すると思います。（当初加えた分のメルカプトエタノールは無視していいです） SDS sampleであっても-20℃保存だと酸化や分解など長期保存中にいろいろおこるようです。特に凍結融解を反復しているとその傾向は顕著になります。なので基本的にはこうしたサンプルでも-80℃保存にし、今後も何度か使用する予定のある重要なサンプルの場合は面倒ですが適宜分注するなどして凍結融解の反復は極力避けるようにしましょう。

古いサンプルでのウェスタン 削除/引用 No.10550-1 - 2022/06/16 (木) 03:19:16 - ema お世話になります。 最近、半年ほど前の細胞破砕液を使ってウェスタンをする必要がありました。サンプルはー20度で保存していました。破砕液はRIPA＋プロテアーゼインヒビターカクテルです。同時にフレッシュな細胞も使ってウェスタンを行いました。細胞は２９３であるたんぱく質が過剰発現したものです。同時にトランスファーおよび抗体でインキュベートした結果があまりにも異なり解釈に困っています。古いサンプルは以前はシングルバンドで出ていたのですが、今回は多くのバンドが出ます。分解されている感じでもなく、目的バンドの上にも多くのバンドが出ます。フレッシュなサンプルのウェスタンはきれいなシングルのバンドです。なぜこのようなことが起こったのか、今別の抗体で試しているところですが、どう解釈すればいいのかヒントが欲しいところです。よろしくお願いいたします。

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