早々にご回答いただきありがとうございます。
>ちょっと細胞ごとクロスリンクするのか、ライセイトをとってクロスリンクするのか混乱されているようなので、１度整理して見てはどうでしょうか、それかもう少しプロトコールを具体的に提示するか。
失礼しました。細胞ごとクロスリンクする前提で質問をしておりました。
順番としては、
細胞に負荷を与える→クロスリンカーを加える→タンパクを抽出
という感じです。
>バイチの成分は細胞外にあるので基本的にPBSを使う限り通常の条件では細胞の中のものとクロスリンクはしません。ただ、細胞外のたんぱく質にクロスリンカーが吸収されてしまうと効率がおちますから。
そうなんですね。安心しました、PBS中でクロスリンカーを使いたいと思います。washしない場合は少し量を多めに使った方が良さそうですね。
>くわえて上記に書きましたように細胞に直接クロスリンカーをくわえるならフォスファターぜインヒビターは入れてもあまりいみがないでしょう。
これは知りませんでした。大変ありがたい情報です。
目的のタンパクはリン酸化のタンパクなのですが、
教官から、細胞に負荷を与えなくなった瞬間にリン酸化状態でなくなるかもしれないから、負荷を与えている状態(培地中の状態)から培地にフォスファターゼインヒビターをいれるようにと言われておりました。
さらに、それ以降のwashなどのときもフォスファターゼインヒビターをいれるようにと。
負荷を与えている状態のときにフォスファターゼインヒビターを入れるのはどうなのか？と思っておりましたが、インヒビターなしの状態での負荷実験をやってみようと思います。
とても助かりました。ありがとうございます。さっそく実験してみたいと思います。 |
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