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(無題) 削除/引用 No.10691-7 - 2022/08/20 (土) 00:48:31 - み PIとRNaseで細胞周期解析する手法は冷エタノールで長時間固定した後に染色操作するはず。 トリプシンで剥がして生きた状態でTx処理というのは不可解ですね。 そのような変法が開発されたのでしょうか。 FACS自体がある種の接着細胞には適用しにくい場合があるのも考慮しておいた方が良い。

Triton? 削除/引用 No.10691-6 - 2022/08/19 (金) 16:36:22 - MM 不勉強なためか、 ＞トリトンで前処理　というのが分かりかね、気になっております。 もしも私の知っている、界面活性剤であるTriton（X-15、100などいろいろ）であるならば、核だけをとるために（細胞膜を溶解して）細胞質を剥がしているという解釈で合ってますか？ だとすると（、核膜が不安定な時期のものは特に）、そもそも核膜も溶解してうまく取れない可能性もあるかと思います。 目的次第ですが、界面活性剤ならば入れない方がよいように思います。 いかがでしょうか？ 最近は、細胞分散用の秘密兵器トリトンという別のものがでているのでしたら教えてほしいです。

ご回答頂いた皆様 削除/引用 No.10691-5 - 2022/08/18 (木) 23:11:18 - NT ご回答頂いた皆様へ 　丁寧にご教授頂き有り難うございます。 　EDTAを投与することで凝集を防ぐことが出来ました。 　ただ、グラフ上G0/G1,S,G2/M期と二峰性にならず、苦慮しております。 　ご指摘頂いたAccumax等も次は使用し行いたいと思います。 　今後もご指導お願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.10691-4 - 2022/08/09 (火) 10:14:06 - ふらいむ 表面抗原は気にしなくて良いようですが、 トリプシン処理のダメージが出ているのかもしれません。 Accumax等、DNase入りでマイルドな酵素処理を試してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10691-3 - 2022/08/09 (火) 01:15:58 - iiii 細胞種によってはFACSや解析に適さないものもあります。理由はお感じのとおりです。自分で解析する場合は考慮の必要があるでしょうし、FACSを技術さんに頼む場合は嫌がられる場合もあります。（最悪機械の中に詰まってしまう場合があるそうです。）凝集しやすい細胞の場合はzamさんのおっしゃるようにメッシュを通したり、オンアイスでなるべく手早く流すなどの工夫や、あるいは解析方法自体を検討し直すことも考えたほうがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10691-2 - 2022/08/07 (日) 04:09:14 - zam 凝集塊を機械的にほぐすのが目的ならば、たとえば25ゲージのシリンジでほぐします。 言わずもがなですが、メッシュを通してからフローサイトメーターに供します。 細胞の凝集を防ぐのが目的ならば、たとえばEDTAを添加したPI/RNase Staining Bufferを使用します。 EDTAの至適濃度は細胞によって異なるので予め条件検討しておくべきですが（終濃度として1〜50mM）、5mM辺りが目安になると思います。 同様の理由でBSAを（も）添加する例があります。 このような小技はフローサイトメトリー本に載っていたりネット上にも転がっていたりするので、ご自分で調べてみるとよいでしょう。

FACSにおける細胞凝集に対する対応策について 削除/引用 No.10691-1 - 2022/08/06 (土) 20:47:25 - NT 研究始めたばかりの初心者です。 現在ある細胞株を用いてcell cycleの実験を行っています。 細胞をdishで培養後、トリプシンで剥がした後に洗浄し、 トリトンで前処理したものをPI/RNase Staining Bufferで15分染色しています。 その後洗浄をした後にFACSにて解析を行っているのですが、 解析前にどうしても細胞が凝集してしまい、上手く測定出来ません。 （ちなみに同様の手順でNUGC3（胃癌細胞株）を用いて計測した結果、特に問題なく良好な結果が得られました。） これは細胞株によってはこの実験系に適さないとするしかないのでしょうか？ それとも何か凝集を防ぐ様な良い手があるのでしょうか？ ご教授頂けたら幸いです。

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