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(無題) 削除/引用 No.10695-10 - 2022/08/09 (火) 12:53:44 - おお Xba1とKpn1で１kbpのインサートを切って、インサートを除いたベクターに別のフラグメントを挿入しようとしているのでしょうか？ もとの１kbpのインサートの中でだけ切れ、かつ新しく挿入したフラグメントにはない制限酵素があるなら、ライゲーション後その制限酵素で切ればバックグランドが相当抑えられることは多々あります。スーパーコイルや予期せぬまじり物をうまく分けきれてなかったこともありえますので。ホスファターゼ処理もLigationの前に施しておいたほうがいいでしょうね。 得られたコロニーが５００ぐらいならベクター側を１０から２０分の１に減らしてインサートとLigationする手もあります。 そうしている間にカットする前のプラスミドは（なるだけオリジナルのチューブに戻り）大腸菌にTransformationして再調製できるようにしてください。たまたま変なコロニーを拾ってしまったとか、精製の過程で何かあったとか（とくに部分変性したプラスミドの割合が多いとか）いう可能性もありますので。

(無題) 削除/引用 No.10695-9 - 2022/08/09 (火) 12:37:24 - G25 ちょっと説明が雑すぎるんでないかい。 >実はインサートは、長いので、明確にバンドとして、1kbの場所に見えています。 このインサートとは何のこと。先の説明では「インサートなしで」と書いているけれど、 空ベクターじゃなくて、1-kbのインサートをもつプラスミドからXbaI, KpnI消化をしたということですか？　それからプラスミドベクター部を切り出したの？ >とりあえず絨毯爆撃的にコロニーpcrをかけようと思いますが、難しいですかね。 何を目的とした操作で、なんのためのコロニーPCRなのか、 文脈には出てこない情報が多すぎる。

(無題) 削除/引用 No.10695-8 - 2022/08/09 (火) 12:36:43 - み KpnIは切れ味悪い印象。 昔はLow salt bufferが至適の酵素でしたよね。 最近はuniversal buffer的な物で同時消化可能ですが、それでやってもKpnを含む組み合わせの物は切れ味悪い。。。 たぶん普通に１０クローンくらいピックアップすれば数個入ってんじゃないですか？ コロニーPCRはプレートに塗り付けたLigation productがtemplateになって増幅される危険性あるんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.10695-7 - 2022/08/09 (火) 12:23:06 - えいじろう 実はインサートは、長いので、明確にバンドとして、1kbの場所に見えています。 切断前と後では全くバンド位置のオーバーラップは見られません。 コロニーはかなりたくさん生えています。少しインサートありでライゲーションしたものの方が多い気もしますが、、、、 2回やって同じ結果でした。2回目は制限酵素処理をかなり強く行いました。 とりあえず絨毯爆撃的にコロニーpcrをかけようと思いますが、難しいですかね。

(無題) 削除/引用 No.10695-6 - 2022/08/09 (火) 11:42:44 - toto XbaIはそういうことが起こりやすいので、あまり使いません。どうしても必要な場合は前もってプラスミドをdamおよびdcmメチラーゼ欠損株のコンピで調製しておきます。これさえやればXbaIでもうまく行きます。

(無題) 削除/引用 No.10695-5 - 2022/08/09 (火) 11:27:56 - おお https://www.neb.com/faqs/0001/01/01/is-xbai-affected-by-methylation これは考慮に入れてますか？ XbaI sites gaTˆCTAGA and TˆCTAGAtc will be blocked by methylation.

(無題) 削除/引用 No.10695-4 - 2022/08/09 (火) 09:47:35 - G25 >Xba1とKpn1でカットしたプラスミドをインサートなしで、t4リガーゼにかけて、トランスフーメーションすると何故か大量にコロニーが現れます。 大量にとはどれくらいか。インプットDNAあたりのCFUでどれくらいの話？ >泳動した限りは完全にカットされていて、uncutのバンドは確認できませんでした。 >原因はなんでしょうか？t4リガーゼにかけずに、トランスフォーメーションは試していません。 泳動するDNA量では見えないレベルの全く切れていないプラスミドが含まれていてもおかしくない。アルカリ法で取ったプラスミドなら多かれ少なかれ部分変性によって制限酵素で切れなくなったフラクション（Ghost plasmid)が含まれるものです。 泳動するのは数十ngかせいぜい数百ngくらいでしょ？その中に多ければ数十から数百ng（一般的な検出限界以下）の切れていないプラスミドが含まれているかも。10　pgもあれば数千はコロニーができる可能性がある。 だから、「大量に」というのがどのくらいのCFU/ugなのかという情報は必要。 ligationなしのコントロールは必要。 あと、二重消化の場合はやらなくてもいいと言われている脱リン酸ですが、やる意義はあります。おおさんの指摘されている、片方でしか切れていないフラクションが再環状化するとか、二重消化で生じたリンカー断片がライゲーションで再組込されるとかの可能性を排除できます。

(無題) 削除/引用 No.10695-3 - 2022/08/09 (火) 08:48:20 - zam おお様のコメントが全てだと思いますが、 なお付け加えるなら、そもそも対照を置かない実験では、原因として多くの可能性が考えられます。 たとえば、プレートの薬剤が失活していたとか入れ忘れていたということさえも、原因として考えられたりします。 修復機構を保持したホストを使えば、ベクターDNA末端の形状にかかわらずコロニーが生えてくる可能性も否定できません。 また、ホスホジエステラーゼを含め生化学実験というものは、必ずしも反応式通りの100%の結果にはならないことを頭に入れておいたほうがよいと思います。すなわち目視では確認できない程度の未消化ベクターも存在する可能性があるということです。 また、1カットと2カットのベクターDNAの大きさが近接している場合は、見分けることが困難です。たとえばpUC18をKpnIとXbaIで処理した場合、1カット（2.7kbp）と2カット（2.7kbp）をアガロースゲル電気泳動で区別することは極めて困難です。 また、仮に1カットと2カットのサイズが目視で十分に区別できるものだとしても、フラグメントを分離回収する際に、除去したはずのフラグメントが混入してしまう可能性も否定できません。これについては、実験の上手下手も関係してきます。 こうしたことを念頭に置くなら、制限酵素処理をしたベクター側を脱リン酸化処理をする必要もあるかもしれません。 思いつくままに原因の可能性をあげました。

(無題) 削除/引用 No.10695-2 - 2022/08/09 (火) 07:54:38 - おお 片方の酵素だけできれたものが混じっている。また、切断された小さなXba1ーKpn1フラグメントを除いてないなら、そのフラグメントがLigationされた。何マイクログラム導入しました？単に多すぎるとか。。。

プラスミド作成が上手くいかない。 削除/引用 No.10695-1 - 2022/08/09 (火) 07:29:52 - えいじろう Xba1とKpn1でカットしたプラスミドをインサートなしで、t4リガーゼにかけて、トランスフーメーションすると何故か大量にコロニーが現れます。 泳動した限りは完全にカットされていて、uncutのバンドは確認できませんでした。 原因はなんでしょうか？t4リガーゼにかけずに、トランスフォーメーションは試していません。

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