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(無題) 削除/引用 No.10701-9 - 2022/08/30 (火) 11:08:18 - 人喰い 続報なのですが、これまできれいにかかっていたプライマーセットでも非特異産物がでるケースが散見されるようになってきました・・・。マスターミックスは小分け保存、cDNAは調製したその日にqPCRにかけています。水とプライマーのみのwellではPCR産物が出ませんでしたので、水の汚染による副産物の可能性は低いのかなと考えています。気になる点としては、ForwardとReverseの100uMプライマーストックを一定量ずつまぜ、dH2Oで希釈して8uM eachの mixture として冷凍保存し、都度融解して使用している点です。これが非特異の原因になるのかはわからないのですが、気になる点がありましたらご指摘ください。 その他、問題解決の糸口になりそうな知見があれば共有いただけると幸いです。 （別トピックでたてたほうがよければご指摘ください）

(無題) 削除/引用 No.10701-8 - 2022/08/16 (火) 08:11:14 - 人喰い 続報です。早速プライマー濃度（nM）を4通り用意して同一のcDNA(12サンプル)を鋳型にqPCRをかけてみました。 100　　　　　　10/12 サンプルで融解曲線に副産物のシグナルあり 200　　　　　　2/12 サンプルで融解曲線に副産物のシグナルあり 300　　　　　　シングルピークの融解曲線 400（従来濃度）3/12 サンプルで融解曲線に副産物のシグナルあり ということでプライマー濃度を下げると融解曲線がシングルピークになる場合があるようです。私のプライマーの場合は非特異ピークの出現と濃度の相関がハッキリしませんし、実験の回によって非特異産物が出たり出なかったりする懸念がありそうです。こういう場合はよりよいプライマー設計を考えたほうがよさそうだと思いました。よいプライマーセットが見つかってこないなか一番マシなペアで融解曲線の非特異が見えたり見えなかったりする状況は悩ましいですね。

(無題) 削除/引用 No.10701-7 - 2022/08/16 (火) 02:22:19 - 人喰い SYBR masterさん 投稿者です。ありがとうございます。Primer 濃度を下げるという方法があるのですね。これまでの検討は推奨濃度の真ん中 0.4 uM でやってきました。プライマーの Tm は 60 ℃くらいになるように設計していたのでアニーリング温度やプライマー濃度の条件は変えてきませんでした。早速低濃度でのPCRを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.10701-6 - 2022/08/13 (土) 16:49:46 - SYBR master >[Re:1] 人喰いさんは書きました : > SYBR Greenを用いたqPCRがうまくいかず、融解曲線解析で非特異産物が出ないプライマーセットが見出せない遺伝子が複数あります。設計方法をうたがっています。おかしなところがあれば教えてください。 あまり知られていないようなのですが、融解曲線解析がおかしいと思うときは、プライマー濃度を下げてみてください。プライマー濃度を下げるプライマーの得意度(=Tm)が上がります。SsoFastだと0.3-0.5 microMがマニュアルの終濃度ですが、0.2-0.3 Mで検討してみてください。ちなみに昔のABIのSYBR Green Master Mixでは0.03~0.1 Mまで下げた経験があります。ただし、立ち上がりが遅くなるのでlow copyのtargetでは注意が必要です。 上記のトラブルシュートは、昔ABIのテクニカルから聞いて試したものです。とりあえず、作り直すより簡単なので試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.10701-5 - 2022/08/12 (金) 08:16:07 - 人喰い おおさん ありがとうございます。個別にblastn検索してみるとQuery coverが70%程度のノンスペがかなり引っかかってしまうことがわかりました。20ペアくらい用意してみましたがきれいなペアを用意するのもなかなか難しいのですね。

(無題) 削除/引用 No.10701-4 - 2022/08/11 (木) 11:14:59 - おお primer blast で得られたプライマー配列を一つづつBlast(n)にかけてターゲット以外かからないか、かかっても相同性が低く3' がわでほとんど一致してないものを優先してはどうでしょうか。 プライマーセットとしてかからないとみなせても、一方のプライマーだけでもアニーリングしやすいところがあれば副産物ができやすくなる可能性が上がると思われるので

(無題) 削除/引用 No.10701-3 - 2022/08/11 (木) 04:13:30 - 人喰い zamさん コメントありがとうございます、投稿者です。やっていることはおかしくないけど私が経験的にまだツボを押さえられていないだけという感じなのかもしれませんね。いまのところヒト細胞とマウス細胞、マウス個体が対象なので設計ツールを使っていますが、これでうまくいかないようであれば自力での設計もしてみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10701-2 - 2022/08/10 (水) 09:54:58 - zam おかしくないように思います。 私もprimer-blastやprimer3plusで選んだプライマーセットの結果が思わしくなく、自分の目で選んだプライマーセットの方が結果がよいときもあります。経験か偶然か分かりませんがそんな状況です。特にヒトやマウス以外の哺乳類を調べるときは、プライマー設計ツールはあまり当てにしていません。あくまで個人の主観ですが。

インターカレータを用いた qPCR primer の設計 削除/引用 No.10701-1 - 2022/08/10 (水) 02:41:24 - 人喰い SYBR Greenを用いたqPCRがうまくいかず、融解曲線解析で非特異産物が出ないプライマーセットが見出せない遺伝子が複数あります。設計方法をうたがっています。おかしなところがあれば教えてください。 ・プログラムには NCBI の primer blast を使用 ・Primer blastに測定したい遺伝子のNCBI ref seq番号を入力 ・PCR product size を80-150に設定 ・Tm 値は 60℃付近を指定 ・Exon junction を少なくとも片側のプライマーが跨ぐように指定 ・非特異産物の判定は対象となる動物の Refseq mRNA とゲノム情報を指定 ・検索の結果得られたプライマーセットから、 　●非特異産物がヒットしないもの（もしくはあっても3000 bp 以上であるもの） 　●Self 3' complementarity が Forward, Reverse とも低いもの 　●Self complementarity が Forward, Reverse とも低いもの 　●3' が T でない という基準を満たしたものを合成依頼しています。上記のやり方できちんと測定できるプライマーが拾える場合もあれば、6-7セット試しても融解曲線解析をクリアできない場合もあります。qPCR 自体は試薬として BIORAD の SsoFast EvaGreen Supermix、検出器にはABI のQuantStudioを用いています。 よろしくおねがいします。

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