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(無題) 削除/引用 No.10703-15 - 2022/08/19 (金) 18:00:36 - Jet では、1%の生存率でもそれを増殖させて、解析すれば、問題ないということですよね。 レンジが本当に狭いのを感じます。プロトコール通りにやっても70%の生存率なんてありえない。。。

(無題) 削除/引用 No.10703-14 - 2022/08/19 (金) 08:17:18 - toto 条件は細胞によって異なって、レンジがすごく狭いので、メーカーが条件を出してることもありますが、ないですかね。特定の細胞集団が生き残ることは考えにくく、残った細胞で調べることができれば問題ないはずですよ。再現性があれば。

(無題) 削除/引用 No.10703-13 - 2022/08/19 (金) 04:57:18 - おお >[Re:12] Jetさんは書きました : > とりあえず、electroporationを試しましたが、ほどよいレンジを探すのが非常に大変ですね。様々な電圧と電気容量を振る以外にはないんですかね。 > > とりあえず、BioradのXcellが手っ取り早いので試しています。 > > > 低い導入効率でもセレクションをかけて残った細胞を解析すれば、問題ないのでしょうか？ 大抵は必要量発現していたならそれでいいです。ただあまりにも効率が悪いときは、細胞に入っているコピー数も少ないだろうから、いんてグレーションするコピー数も少ない場合もあって弱い発現しかしないとかいう場合もないことはない。ただ標準の薬剤濃度で生き残るならのぞみはあるとおもう。 細胞によるのかもしれませんが導入するプラスミドを線状にして（発現ユニットと関係ないところで制限酵素できる）、導入すると導入されやすい場合があります。

(無題) 削除/引用 No.10703-12 - 2022/08/18 (木) 18:42:42 - Jet とりあえず、electroporationを試しましたが、ほどよいレンジを探すのが非常に大変ですね。様々な電圧と電気容量を振る以外にはないんですかね。 とりあえず、BioradのXcellが手っ取り早いので試しています。 低い導入効率でもセレクションをかけて残った細胞を解析すれば、問題ないのでしょうか？ あるいはやはり導入効率を最大限高めるべきでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10703-11 - 2022/08/14 (日) 07:07:05 - おお >[Re:10] Jetさんは書きました : > Nucleofectorですか、、、BioradのXcellを考えていました。 > > 聞いてみたところ、同じビルにnucleofector model 2bというのがあるのは確認したのですが、かなりold typeのようです。みなさんが話されているのはもっと最新機種ですよね？ うちは初期型（アマクサって会社が作った一番最初のやつ）を今も使ってます。発売当初から評価が高かったです。だから最新だからよく入ってうまくいくという話でもないです。だってちゃんと入って実験が成り立つんだから何が問題よってこと。最新型はキュベットの形が今までの大抵のポレーションとコンパチブルな仕様からわざと形を変えているようなのでバルクである程度安く買えるものが使えないかも。 最新型にこだわるようだけど、顕微鏡とかナノドロップみたいな吸光度を測るものとか最新型じゃないと実験が成り立ちませんか？うちはナノドロップ以前のファルマシアが出しているDNA用測定吸光度系を使ってますが。

(無題) 削除/引用 No.10703-10 - 2022/08/14 (日) 03:34:28 - Jet Nucleofectorですか、、、BioradのXcellを考えていました。 聞いてみたところ、同じビルにnucleofector model 2bというのがあるのは確認したのですが、かなりold typeのようです。みなさんが話されているのはもっと最新機種ですよね？

(無題) 削除/引用 No.10703-9 - 2022/08/13 (土) 10:12:18 - toto お金のかかるのはあまりおすすめしたくないのですが、経験から行くと、Nucleofectorは高いだけあって、浮遊細胞系でもよく入ります。生き残ってる細胞のほぼ100％に入ってます。好きかどうかで行くと、レンチを押したいところですが、やはり時間がかかり、選択しないと行けないので、結局、どこかで躓いたりやらかしたりして、終了になることが多くて。こちらの問題ではありますが。 Nucleofectorはもちろんエレポですが、Bioradなどの古典的なエレポとは格段の差を感じます。至適化を続けた結果、というのが導入効率とお値段に反映されてるのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.10703-8 - 2022/08/13 (土) 09:38:03 - mp レンチ信者というわけではないですが、stableでbulkで解析となるとレンチの方が効率的かつ無難ではないかと思いますね。 plasmidだと任意の場所で切断されて染色体に組み込まれるので、場所によっては薬剤耐性だけど目的遺伝子が発現しないということもあり得ます（IRESを使えばOKかもしれないが）。 またplasmid transfectionだと細胞ごとの発現量にかなり幅がありますが、レンチの場合はある程度一定になる印象があります。例えばGFPの発現をFACSで見るとplasmid transfectionは低い山というか台地がだらだら続いているのに対し、レンチの場合はピークを示す山がある印象です。 その他、プロモーターやMOIを変えることで発現量もある程度調節可能、サイレンシングを受けにくい、100％感染させられれば薬剤選択不要といった利点もあるかと思います。 もちろん遺伝子の大きさやエレポ装置の進化などを考慮すると一概には言えないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.10703-7 - 2022/08/13 (土) 03:35:33 - おお >[Re:6] Jetさんは書きました : > 気になるのは、感覚的にウイルスの方がsophisticatedでエレクトロポレーションは古典的なイメージがありますが、そんな気にする点ではないですかね。 > 今も普通に使われてますけどね。Nucleofectorなんかは何年か前にhigh throughput用機種を販売してますし。 あとESやiPSではポレーションは実験として樹立しているというかやりやすい方法で、シングルコピーを入れるとかそういうマニピュレーションもできたりするし。 > レビューアーからの評価が変わったりしますか？ 最近のポレーションをつかった論文を見てみたらどうですか？最近はレビューのヒストリーなどを公開している論文もあることですし。 > > また、いずれの方法を取るにしてもstableを回収する予定ですが、single cloneを取るのではなく、bulk stableを回収すれば十分ですよね？ > できればbulk stable （Pooled）でしたいところですね。クローンを拾うと平均的な細胞から逸脱した特殊なものを拾ってないかという問題がいつも付きまとうので。 ただPooledで好ましい発現量になっているかはやってみないとわからないわけで、一応プラスミド量をふったりはできなくもないけど、最大のプラスミド量でももう少し発現がほしいなぁとなると、、、

(無題) 削除/引用 No.10703-6 - 2022/08/12 (金) 17:19:32 - Jet 気になるのは、感覚的にウイルスの方がsophisticatedでエレクトロポレーションは古典的なイメージがありますが、そんな気にする点ではないですかね。 レビューアーからの評価が変わったりしますか？ また、いずれの方法を取るにしてもstableを回収する予定ですが、single cloneを取るのではなく、bulk stableを回収すれば十分ですよね？ 基本的には、pathwayを調べたり、表現型を見ることになります。

(無題) 削除/引用 No.10703-5 - 2022/08/12 (金) 14:31:15 - おお ちょっと不思議なのは、薬剤耐性の安定導入株を作ろうとしているようだけど、chemical reagentを使って全然コロニーができないってことはあんまりなさそうな気がしますが、、、

(無題) 削除/引用 No.10703-4 - 2022/08/12 (金) 14:19:34 - おお >間違いではないでしょうか。 実は間違えだと思っているのか、 間違えじゃないだろうと感じているのか、、、 とにかく、chemical reagentを使っている場合レンチなどにパッケージングできないものを使っている可能性も大だから、その遺伝子をレンチ用ベクターに載せ替えてパッケージングしている間を待たずしてポレーションはできるわけで悪い選択肢ではない。 あと間違えとか正解とかあるわけではないので、メリットやデメリットを調べて天秤にかけるといいです。レンチは遺伝子が大きい（長い）とパッケージングできなくなります。

(無題) 削除/引用 No.10703-3 - 2022/08/12 (金) 13:20:42 - zam 結論を先に言えば、やってみなければわかりません。 まず浮遊細胞と一口に言っても多種多様です。初代培養細胞と株化細胞でも導入効率は異なります。ウイルスも色々、エレポも色々です。 ウイルスベクターは、ウイルスの種類及びラボのバイオセーフティーレベルによっては使用できない場合もあります。まあこの手の質問をされるところならば問題ないのでしょうが。 ウイルスの調製も手間と言えば手間です。こうした点から敬遠されている場合もあるかもしれません。 ウイルスベクターによって、浮遊細胞への感染効率を高める手法があります。 エレクトロポレーションはメーカーや機材にもよりますが、初期投資にお金が掛かります。一式揃えるのに数百万円掛かるものもあります。既に機材が揃っているとか、別の部屋から借りられるなら（学内共通機器とか）、エレポを最初に使うのはよいと思います。 細胞の種類によってはエレポ条件やプロトコールがあることもあります。特にヒトやマウスならば、割と色々な細胞の種類毎に条件が揃っていると思います。一方、マイナーな生物を使っている場合は、細胞の種類にもよりますが、条件未知のことが多いので、条件検討からやらないといけません。これが結構手間です。 血球系細胞は、エレポが入りにくく、レンチのほうが割といい感じがします。あくまで個人の主観です。 ちなみにCHO細胞ならば、どの方法でやってもうまくいきます。これも個人の主観ですが。 selectionをかけるに当たっては、エレポ条件によってはviabilityが悪いことがあるので条件次第ではありますが、まあ、レンチもエレポも大差ない感じです（もっとも、同時に比較したことがないのでなんとも言えない）。むしろそれ以外の諸要因の方がはるかに大きい。

(無題) 削除/引用 No.10703-2 - 2022/08/12 (金) 12:59:31 - 774 selectionをかけてからどれくらいのスパンで実験をするか次第じゃないでしょうか？ 短期間でselectionをかけて生き残った細胞を一気に使うのか、stableを取得するのか。 stableを取るならレンチ・レトロの方が楽な気がします。 そうでないならどちらでも問題ないと思います。

浮遊性細胞の遺伝子導入 削除/引用 No.10703-1 - 2022/08/12 (金) 12:09:10 - Jet 浮遊性細胞の遺伝子導入を検討していますが、既存のchemical reagentは効果がほぼないことが分かりました。 そこで他の方法を検討しています。 様々な論文の総論を見ると、どちらかというとウイルスよりも、エレクトロポレーションを最初に試すような書きぶりなのですが、selectionをかける点で同じであれば、時間のかからないエレクトロポレーションを採用することは間違いではないでしょうか。 遺伝子を導入して、selectionをかけたのち、様々な実験を行う予定です。

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