BioTechnicalフォーラム [レトロウイルスのprovirusのPCRについて]

レトロウイルスのprovirusのPCRについて

No.1088-TOPIC - 2012/11/01 (木) 20:40:11 - コロスケ

いつも勉強させていただいております．ウイルスの初心者です．どうぞご教授くたざい．

レトロウイルスを培養細胞に感染させ，培養細胞を回収→DNA抽出しprovirusをPCR法を用いて検出するという実験系を行なっています．

そこで，論文から引用したprimerを用いているのですが，このプライマーが１つは5‘LTR領域の，もう一方は３‘LTRの領域にbindingするように設計されています．
さらに，このプライマーの設計ではPCRの伸長反応がprovirusに対して外側に向かうように設計されていました．つまり，host genome側に伸長反応が進むと理解しています．

初心者の私は，これが何を意味するのか理解できませんでした．

このような手法はレトロウイルスを扱う上では一般的な方法なのでしょうか．また，このような手法でprovirusを検出する原理をご指導いただけると大変ありがたいです．

ちなみに，引用論文ではこのprimerを用いて系統樹も作成しているのでLTR領域をちゃんと増幅させているのだと思っています．
　

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No.1088-8 - 2012/11/02 (金) 20:57:21 - Harmonia

provirusを切断しない、かつ、ゲノムをずたずたに切る制限酵素で消化し、
セルフライゲーションの後にPCRをかけるのではなく？
もっとも、これだとウイルスの配列ではなく、ゲノムの挿入位置の同定と
しかなりませんが。

系統樹って、何の配列を元にした系統樹ですか？

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No.1088-7 - 2012/11/01 (木) 23:17:56 - コロスケ

774様

ご回答ありがとうございます．

しっかり論文を読みなおすことから始めさせて頂きます，勉強になりました．

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No.1088-6 - 2012/11/01 (木) 23:16:27 - コロスケ

AP様

>> LTRは完全な同方向反復配列なので、5'LTRから外向きのプライマーは3'LTRから内向きのプライマーとして働くし、3'LTRから外向きのプライマー5'LTRから内向きのプライマーとして働く

ご指導ありがとうございます．complete sequenceで確認したところ5'LTRからの外向きのプライマーが3'LTR領域にbindingするようなことはないと確認したつもりでしたが，私の見逃し，勘違いかもしれません，ありがとうございました．

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No.1088-5 - 2012/11/01 (木) 22:41:40 - 774

むしろLTRを増幅させて、その配列で系統樹を描くのが目的かもしれませんね。
inverse PCRでintegration siteを同定するような実験の可能性もありえなくはないです。
文章中に目的が書かれてるでしょうから、がんばって読み込んでください。

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No.1088-4 - 2012/11/01 (木) 21:58:03 - AP

へたにプライマーを設定すると、provirus内部を増幅せずに、LTRのみを増幅してしまいますね。

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No.1088-3 - 2012/11/01 (木) 21:17:35 - 774

LTRは５’も３’も同じ配列ですよね？
そうするとprimerの結合する箇所はそれぞれ2箇所になるわけです。
一応、provirusは増幅されます。