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(無題) 削除/引用 No.10897-10 - 2022/11/03 (木) 06:30:33 - おお もしLarge prepでつまづくなら必要量を考慮しながらMiniprepで完結させるてもあると思います。Just in case.

(無題) 削除/引用 No.10897-9 - 2022/11/03 (木) 05:34:14 - plasmid 低温度での培養の結果が出ました。後学の為に報告させて頂きます。 一度に複数パラメータを変えるのは本当は良くないな、と思いつつも、 1）heat shockを42C、30秒から37C、30秒に変更した 2）heat shock、氷上静置5分の後、vector DNAとcompetent cell 50ulに対して450ulのsoc培地を加え、pre-cultureはせず、150ulずつ3枚のLB plate ( Ampが1x, 0.5x, 0.25x。1xは50ug/ml）に捲いて、室温（調べたところ日中で20C位。夜間は少し下がって18C位）で培養 を行いました。結果、2日目終わり頃に（以前よりも大分少な目に）コロニーが見え始め、4日目まで放置しておいたところ、通常の大きさのコロニー（という言い方はどうなのか。質問文に書いたような、異様に小さいコロニーと違って、今までに形質転換した時に見られたような普通サイズのコロニー）が9割程度（目算で100〜200個位？）で、1割程度は質問文に書いたような異様に小さいコロニーが育ちました。アンピシリン濃度の違いによるコロニーの生え方の違いは私の場合ではあまり見られませんでした。 それぞれのプレートから通常の大きさのコロニーを3つずつ拾って、30C、250rpmでの培養を24時間行ったものをミニプレップ、制限酵素処理、ゲル電気泳動してみたところ、9つ全て目的のDNAでした。 実は、問題になったlentivector DNAは二つあり、両方で同じ結果（9つ拾って9つ当たり）が出ました。37度でのヒートショック、室温でのLB plateの培養、低温（30C)でのLB培地の培養で、非常に良好な結果が得られました。 Large scaleでの培養はまだ試していませんが、恐らく問題は無いと思っております（最後の1時間でアンピシリンを加えて37Cに上げるのがもしかしたらトリッキーなのかもしれませんが、まあ、大丈夫でしょう）。 皆様のお陰で、非常に良好な結果が得られました。ありがとうございました。 (エラーメッセージが出て「解決」に出来ないのですが、無事に問題解決出来ました）

(無題) 削除/引用 No.10897-8 - 2022/10/28 (金) 08:10:11 - plasmid おおさん、ありがとうございます。まずは低温度での培養等すぐに出来るところから始めてみます。結果の報告は、なにせ培養時間などがかなり長いので先になるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.10897-7 - 2022/10/27 (木) 09:45:00 - おお >[Re:6] plasmidさんは書きました : > まずは、おおさんの仰る > >なるべく大腸菌内では低いコピー数で維持するように工夫する > を試してみようと思います。以下の方法をやってみます。 > 2) 抗生物質（私のベクターではAmp）の濃度を下げる。半分から三分の一ぐらい > これ、濃度を「下げる」ですか？「上げる」ではないでしょうか？ちょっと私の理解が追い付いておりません。 抗生物質の量を下げることで耐性遺伝子産物の必要量ががさがりますので、大腸菌がそれほど多くのプラスミドコピー数を維持する必要がなくなるということです。 > > 低温度での培養について質問があります。30度での培養は通常の37度での培養より時間がかかるのではないか(37度なら14-16時間程度のところを、24-30時間とか？） ２４時間くらいは見たほうがいいかもしれません。 > それと、長い培養時間の場合でAmpの場合、培養の途中で（15時間くらいで？）Ampを追加しますか？ 必要であれば私は最終的に回収するときに、遠心で回収した大腸菌（培地を捨てたペレット、できれば一度洗ったほうがいいらしい）にLB＋Ampを加えて３７度でしばらくおくことがあります。

(無題) 削除/引用 No.10897-6 - 2022/10/27 (木) 06:25:20 - plasmid 皆様レスありがとうございます。下記、追加の質問があるのですが、よろしくお願いいたします。 挿入した遺伝子が悪さをしているとは考えていなかった（lentivectorではなくpcDNAに入れた場合にはこんな問題は起きていないから）のですが、zamさんの仰る >2種のDNA配列の存在によって何らかの相互作用が生じた が有り得るのであれば、バックボーンのレンチベクターと挿入したDNAとの相互作用で大腸菌に都合の悪いことが起こった可能性があるのですね。 まずは、おおさんの仰る >なるべく大腸菌内では低いコピー数で維持するように工夫する を試してみようと思います。以下の方法をやってみます。 1）培養を低温度で行う。Brothの培養なら30度、プレートなら室温放置、等。 2) 抗生物質（私のベクターではAmp）の濃度を下げる。半分から三分の一ぐらい これ、濃度を「下げる」ですか？「上げる」ではないでしょうか？ちょっと私の理解が追い付いておりません。 3)Maxi-prep用のlarge-scale prepでは、30度で培養しておいて、最後の1時間だけ37度に上げる。収量を上げる為のtips。 4）ヒートショックを42度ではなく37度で行う。あるいはヒートショック無し。 42度、37度、無しの3通りで試してみようと思います 低温度での培養について質問があります。30度での培養は通常の37度での培養より時間がかかるのではないか(37度なら14-16時間程度のところを、24-30時間とか？）と思うのですが、そんなことはないでしょうか？皆さんはどれ位の時間培養されますか？ものによって違うのかとは思いますが、目安として教えて頂けますか？ それと、長い培養時間の場合でAmpの場合、培養の途中で（15時間くらいで？）Ampを追加しますか？ それと、やはりこの場合は収量が低くなるのは避けられないと思います。なので、例えばMaxi-prepのキットを使う場合、low copyのプラスミドの場合の培養液の量（通常は100mlのところを、low copyだと500ml等）を使っておられますか？ よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.10897-5 - 2022/10/26 (水) 14:56:48 - mp NE-stable大腸菌あたりを試してみたらいいかも。

(無題) 削除/引用 No.10897-4 - 2022/10/26 (水) 13:39:52 - zam ちなみに形質転換効率は低いですが、ヒートショックなしでもコロニーは生えることがあります。というか、生えます。私の好きなやり方です。

(無題) 削除/引用 No.10897-3 - 2022/10/26 (水) 13:25:07 - zam 大腸菌は増えたのに、ミニプレップでDNAがまったく取れなかった経験はあります。 私の場合も、トピ主さんのように、単独では普通に生えてくる配列が、切り貼りして繋げると、生えが悪くなったというケースです。 2種のDNA配列の存在によって何らかの相互作用が生じたものと推測しましたが、深追いしていないので真相は不明です。 なおご存じだと思いますが、アンピシリンの場合は、形質転換大腸菌が少量でも存在すれば、いずれ培地中のアンピシリンが分解されて有効濃度を下回り、プラスミドを持たない大腸菌のほうが増えてしまうことはありえます。 対処方法はおおさんが書いてあるとおりだと思います。 私の場合は、プラスミドの薬剤耐性遺伝子をカナマイシンに変えることで解決しました（それでも収量は少なかったです）。

(無題) 削除/引用 No.10897-2 - 2022/10/26 (水) 09:51:29 - おお たまに挿入した配列が大腸菌にワルサしているのではないかと思える、お示しのようなプラスミドに遭遇することがあります。大腸菌に悪さしているという前提でなるべく大腸菌内では低いコピー数で維持するように工夫することが多いです。また大腸菌の相性も考えて複数の種類のコンピテントを使ってみるというのもやることがあります。 低コピーで維持するには低い温度で大腸菌を増殖させる３０度ぐらい。２５度でもやれなくはないけどちょっと遅いので余裕があればそれでもいいかも。特にプレートにまいた場合はインキュベーターに入れずベンチに放置しておくとかでもいいかもしれません。加えてセレクションマーカーの抗生物質を下げる（半分から三分の一ぐらい）とコピー数も減られます。 Large prepなどのばあいも３０度ぐらいで増やしておいて、回収の１時間前ぐらいに３７度に上げてコピー数を底上げしてから回収すると増殖中はなるべく大腸菌への影響を抑えることができるでしょう。 あと理由がよくわかってないのだけど、そのようなプラスミドはTransformationのときヒートショックを３７度でやったほうが毒性のあるプラスミドを作るときにベターだという話もあります。

lentiベクター: 形質転換後のコロニーが異様に小さく外ればかり 削除/引用 No.10897-1 - 2022/10/26 (水) 08:17:01 - plasmid 要約: lentiベクターを構築し、形質転換したところ、異常に小さいコロニーしか出来ない。当たりは（シングルコロニーから）なんとか拾えたが、これを再度形質転換したところやはり異常に小さいコロニーしか出来ず、これらのコロニーは、シングルコロニーから拾ったのにも関わらずほとんどが外れ（LBプレート上に存在するコロニーなのにLB液体培地で育たない、あるいは育ってもこれをミニプレップをするとDNAが無い）。何故？ これまでpcDNAをバックボーンとするような発現ベクターは100以上作ってきました。今回、リポフェクションが難しい（導入効率が非常に低いprimary cultureの）細胞に導入する為に初めてlentivirusを使う事になりました。そこで、addgeneからpLenti-CMV-GFPを購入し発現させたいDNAを（EGFPとのfusion proteinになるように）組み込んでベクターを構築しました。 ここで問題が起きました。このベクターをDH5aを使って形質転換、SOC培地を加えてpre-cultureを1時間行い、Amp入りのLBプレートに捲いたところ、翌日出てきたコロニーが異常に小さいのです。元のpLenti-CMV-GFPを同じようにして捲いても、そのような小さいコロニーは出ません。過去に作ったpcDNAのベクターと同じ位の大きさのコロニーが出来ます。 なんか変だなと思いながらも、コロニーをつついてLB培地で培養、ミニプレップをして制限酵素で切って電気泳動して確認といつも通りの作業を行いました。結果、30数個拾って、半分は育たず（LB培地がクリアなまま）、残りの半分のうち当たりが2個だけ、あとの残りはバンド無しという結果になりました。 過去の経験では、LB培地が十分に濁ったものをミニプレップをしてバンド無しに終わったことは（皆無ではないものの）ほとんどありません。今回のlentivectorではほぼ半分がバンド無しになってしまいました。 それでも、取りあえず当たりは拾えた（し、かつこのベクターで293T細胞でウィルスをパッケージ出来、primary culture細胞での目的遺伝子の発現も上手くいった）ので良しとしていたのですが、この当たりのベクターDNAを再度形質転換したところで問題が起きました。 コロニーをつついてLB液体培地で培養〜の作業を行ったところ、30個以上拾って半分は育たず、残りの半分はバンド無しです。まだ当たりは拾えていません。うまく作った筈のベクターDNAを失ったのではないかと戦々恐々としているところです。 過去に同じような経験をされた方おられましたら、どうやって問題を解決されたか教えて頂けますか？　購入したpLenti-CMV-GFPベクターではこのような問題は起きていないので、lentivectorに特異的な問題とも思えないのですが、かといって、入れた遺伝子の影響でこうなったというのも考えにくい（lentivectorではなくpcDNAに入れた場合にはこんな問題は起きていないから）と思っています。原因がわからなくて途方に暮れております。

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