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共免疫沈降実験のSDSページのローディング量 トピック削除
No.10913-TOPIC - 2022/10/31 (月) 11:16:40 - US
共免疫沈降実験のSDSページのローディング量をどうするかで悩んでいます。
inputのうち何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするべきなのでしょうか。
あるいは、結合していることが分かるようにビーズフラクションは大量に流すべきでしょうか?
 
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No.10913-7 - 2022/11/01 (火) 09:01:41 - おお

>[Re:1] USさんは書きました :

> inputのうち何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするべきなのでしょうか。
> あるいは、結合していることが分かるようにビーズフラクションは大量に流すべきでしょうか?

>[Re:6] USさんは書きました :
> つまり視覚的に割合を、判別する必要はないから、各々流せるだけ、流したらいいということですね?


なんだか伝わってるんだかつたわってないんだか。。。

視覚的に割合を判別して、何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするつもりだったんですか?それで正確に何がわかるのですか?

プロトコールでポピュラーなのは50から100ulで抗原をビーズから剥がすというもので、それぐらいの容量だと全部は流せないでしょう。一割から二割です。であなたの仰っている大量はどの程度なんですか?無理せず流せる上限ですか、それとも無理してでも流すことを言っているのですか?

ビーズを洗ったあと完全に水分が除ける訳ではないので、それを考慮すると(ビーズの量や種類によるでしょうけど)100ulぐらいのボリュームで溶出するとビーズに含まれる水分量はなるべく誤差の範囲に抑えられてある程度正確にどれくらい結合したかなど見積もりやすくなるということだと思います。

また、サンプルバッファーなどを10ul位入れてボイルしてそのまま全部流すという手もあるにはあります。全部流すのだから定量的な計算は成り立ちます。ただし場合によってはバックグランドが上がることもあるようです。

結合が見れるようにといいますが、10%使っても結合が見れる場合も結構ありますから大量に流すというのが解決策とまでは言えないと思います。

あとは実験の目的をよく考え、同じようなIPをやっている研究があるならそういう論文やThesis(こっちのほうが方法論的には多分詳しい)をみて、プロトコールも成書に載っているものを読んで(Current protocols, Molecular biology などなど)方針を決めなさい。それでも方針を決められないなら予備的な実験をしてどれがベターか判断すればいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.10913-6 - 2022/11/01 (火) 07:29:12 - US
つまり視覚的に割合を、判別する必要はないから、各々流せるだけ、流したらいいということですね?

(無題) 削除/引用
No.10913-5 - 2022/11/01 (火) 06:27:12 - おお
たくさん流そうが、何割かを流そうが、流した量からお考えの計算はできると思います。なので質問の意図がよくわかりません。

(無題) 削除/引用
No.10913-4 - 2022/10/31 (月) 16:34:53 - おお
>[Re:3] 1さんは書きました :
> 市販抗体の場合、使用する抗体の量は限られるでしょうしビーズの量、結合キャパシティも限られていますから、補捉できる抗原(複合体)の量もおそらく全体の一部になると思われます。そうしたいろいろな要素が介在していますので定量的な評価は困難と思われます。もともと定性的な実験と考えた方が良い様な気がします。多価の抗血清なり抗体をたくさん持っていて、ビーズを使わなくても免疫複合体を沈殿させることができる状況ならば、至適な抗原と抗体の量比を条件を検討すれば可能かもしれませんが(つまり本当の免疫沈降)。
>

抗体はマイクログラムオ-ダ-で、ビーズのキャパは通常のプロトコルではそれをうわまっていますから、理想的に完全に補足できるであろうタンパクは多いと思います。実際に沈降後のLysateをチェクして全て回収出来ているかチェックしていると言う方が、このフォーラムにいました。

(無題) 削除/引用
No.10913-3 - 2022/10/31 (月) 13:17:32 - 1
市販抗体の場合、使用する抗体の量は限られるでしょうしビーズの量、結合キャパシティも限られていますから、補捉できる抗原(複合体)の量もおそらく全体の一部になると思われます。そうしたいろいろな要素が介在していますので定量的な評価は困難と思われます。もともと定性的な実験と考えた方が良い様な気がします。多価の抗血清なり抗体をたくさん持っていて、ビーズを使わなくても免疫複合体を沈殿させることができる状況ならば、至適な抗原と抗体の量比を条件を検討すれば可能かもしれませんが(つまり本当の免疫沈降)。

(無題) 削除/引用
No.10913-2 - 2022/10/31 (月) 13:17:24 - 774R
inputのうち何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかを示したければ、そのようにローディングすれば良いですし、
結合していることが分かるようにしたければ、ビーズフラクションを大量に流せば良いと思います。

共免疫沈降実験のSDSページのローディング量 削除/引用
No.10913-1 - 2022/10/31 (月) 11:16:40 - US
共免疫沈降実験のSDSページのローディング量をどうするかで悩んでいます。
inputのうち何割がベイトに結合して、何割が上清にあるかが正確に分かるようにローディングするべきなのでしょうか。
あるいは、結合していることが分かるようにビーズフラクションは大量に流すべきでしょうか?

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