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(無題) 削除/引用 No.10929-11 - 2022/11/05 (土) 10:12:46 - JJ おお様 ウイルスはAAVです。レンチはあまり詳しくないですが、タカラのAAV作成キットではFBS含まないのを推奨のようです。 https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/6676-6678_j.pdf

(無題) 削除/引用 No.10929-10 - 2022/11/05 (土) 00:48:58 - おお >[Re:9] JJさんは書きました : > mont様 > ご返信ありがとうございます。 > こちらはウイルスベクターの作成用で、ベクターのトランスフェクション後は、無血清のDMEM培地にて培養することがマニュアルの推奨となっています。 > > ウイルスベクターを抽出、精製の際に血清が残っているのがよくないことが理由です。トランスフェクションの後24時間経過してから、無血清のDMEM培地に培地交換して、3-5日後にベクター抽出〜精製の作業を行うと記載されてます。 > 樹立されている方法論のようなので、まずはその通りやってみればどうでしょうか。樹立された環境などではそれでうまくいっているわけですし。それで少し具合が悪いようであれば工夫を加えるぐらいのほうがいいかと。 ちなみにウイルスはレンチですか？もしそうなら参考にしたプロトコールを示していただけますか？何も考えずに血清ありの培地でやってたので、後で築いたけど、血清抜きたいときはペレットとして回収しないととおもい、、、まあ当面は困らないのですが、ターゲットの細胞を変えたときのことを考えると、、、

(無題) 削除/引用 No.10929-9 - 2022/11/04 (金) 23:23:58 - JJ mont様 ご返信ありがとうございます。 HEK293細胞は扱いが少し難しいのですね。 ありがとうございます、参考にいたします！ おお様 ご返信ありがとうございます。 こちらはウイルスベクターの作成用で、ベクターのトランスフェクション後は、無血清のDMEM培地にて培養することがマニュアルの推奨となっています。 ウイルスベクターを抽出、精製の際に血清が残っているのがよくないことが理由です。トランスフェクションの後24時間経過してから、無血清のDMEM培地に培地交換して、3-5日後にベクター抽出〜精製の作業を行うと記載されてます。

(無題) 削除/引用 No.10929-8 - 2022/11/04 (金) 03:15:50 - おお >[Re:6] JJさんは書きました : > おおさま > 誘導期による細胞接着くらいは起こりえるでしょうか？ ちょっと理解が追いつきませんが（どういう手順の実験を考えているのか検討もつかない）、、、 通常の血清入り培地で一度接着したものは無血清に置き換えても培養していて剥がれてくることはないと思いますが。ただだんだん調子は悪くなってくると思います。

(無題) 削除/引用 No.10929-7 - 2022/11/04 (金) 00:16:01 - mont HEK293は薄く播くと、増殖の立ち上がりがすごく遅くなる様に感じます。 HEK293はディッシュへの接着性が弱く、ディッシュの種類（接着性の違い、特にコーティングの有無）もコンフルエント量に大きく影響します。 またトランスフェクション効率やストレス耐性なども、細胞密度に敏感に左右されるように感じます。 なので、他の細胞に比べると、「HEK293は細胞密度に気を使って実験しないと」と思う細胞です。感覚的な感想なのですが、参考まで。

(無題) 削除/引用 No.10929-6 - 2022/11/03 (木) 21:07:06 - JJ おおさま そうですか、わかりました。 DMEM無血清では増えないのですね。 誘導期による細胞接着くらいは起こりえるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.10929-5 - 2022/11/03 (木) 15:26:15 - おお DMEMだけで無血清ではほとんど増えないと思います。

(無題) 削除/引用 No.10929-4 - 2022/11/03 (木) 13:43:45 - JJ 5963様 ご返信ありがとうございます。 大変参考になります。ありがとうございます。 おお様 ご返信ありがとうございます。 播種とコンフルエントの細胞量は、dishの底面積に依存するのですね。 ということは、例えば100mmディッシュにまく場合、培地量はおよそ10ml程度だと思いますが、こちらを15や20mlに増やしても、コンフルエント量は一定と考えて差し支えないでしょうか？ 少々濃く細胞をまく場合は問題ないとして、薄くまくときは、注意しないいといけないということですね。 すみません、あともう一点だけ質問よいでしょうか？ DMEM培地を無血清で培養する場合、増殖速度はどの程度遅くなるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.10929-3 - 2022/11/03 (木) 01:58:56 - おお >[Re:1] JJさんは書きました : > こんばんは、もしわかる方いらっしゃれば教えてください。 > > 現在、DMEM培地にてHEK293細胞による細胞培養を行っております。 > > 細胞培養用のdishやフラスコは、各サイズによって播種の細胞量とコンフルエント量がある程度決まっているかと思いますが、こちらは、接着細胞の場合は基本的にdishやフラスコの底面積に依存していると考えてよいでしょうか。 Yes > > また、仮に10mmdishの場合、推奨の播種細胞量が2〜3×10^6程度でコンフルエント量が8.5〜9×10^6程度だと認識していますが、播種細胞量が例えば1×10^6や5×10^6のように少なかったり多かったりする場合は、コンフルエント量はどのように変化するでしょうか？ 変化しません。8.5〜9×10^6に達するとコンフルエント > 推奨量と異なる播種細胞数の場合、増殖に時間がかかったり、効率が悪かったりと影響があったりするでしょうか。 効率がなにの効率のことを言っているかわかりませんが、低いポピュレーションで増殖が遅くなったりする細胞もありますし、調子が悪くなり増えなくなったり形質が変わってしまう細胞もあります。薄くまくときはそういう点に注意しましょう。 > > 素人質問申し訳ありません。 > ご教授いただけますと幸いです。どうぞよろしくお願いします。

培養乙 削除/引用 No.10929-2 - 2022/11/03 (木) 01:37:26 - 5963 株細胞でしたら無限増殖性と考えて良いと思うので、播種細胞数によらず、いずれはコンフレントに達します。ただ当たり前ですがコンフレントになるまでの時間は、少なく撒けば時間がかかりますし、多く撒けばより早くなります。推奨条件はたぶん播種後２〜３日でコンフレント近くになるようなことを想定しているのではないかと思います。正常組織由来の株細胞ではコンフレントになると増殖を停止します（接触阻止と言います）が、腫瘍細胞由来の細胞株の中にはコンフレントに達してもだらだら増殖を続けるものもが多いです。この場合は細胞の上に細胞が重層するようにして増えたり（パイリングアップ）浮いたりします。 株細胞も何回も分裂していると多核の細胞とか、本来のその細胞とは形や大きさの違う細胞など変な細胞も出てきます。細胞全体に占める割合としては少数ですが。多くは細胞質分裂ができなくて継代していく中で淘汰されていきますが、そうした細胞が目立つようになったら、新しく凍結保存していた細胞を使った方が良いと思います。 播種密度で注意すべきことは、あまり細胞数を少なく播種すると、細胞の調子が悪くなったり増殖の立ち上がりが遅れたりします。また細胞によっては死んだりします。その時々の実験の都合もありますし、必ずしも推奨播種細胞数を守らなくてはいけないということはないですが、播種細胞数が極端に少ないと細胞がうまく増えないことはあるかもしれません。 分裂回数に限界のある初代培養細胞の場合は株細胞とは勝手が違い、限りある分裂回数を無駄に先に進めないようにいろいろ注意が必要なので、そういう細胞を使われる際にそれはそれで勉強してください。

dishによる播種細胞量とコンフルエント量について 削除/引用 No.10929-1 - 2022/11/02 (水) 23:58:46 - JJ こんばんは、もしわかる方いらっしゃれば教えてください。 現在、DMEM培地にてHEK293細胞による細胞培養を行っております。 細胞培養用のdishやフラスコは、各サイズによって播種の細胞量とコンフルエント量がある程度決まっているかと思いますが、こちらは、接着細胞の場合は基本的にdishやフラスコの底面積に依存していると考えてよいでしょうか。 また、仮に10mmdishの場合、推奨の播種細胞量が2〜3×10^6程度でコンフルエント量が8.5〜9×10^6程度だと認識していますが、播種細胞量が例えば1×10^6や5×10^6のように少なかったり多かったりする場合は、コンフルエント量はどのように変化するでしょうか？推奨量と異なる播種細胞数の場合、増殖に時間がかかったり、効率が悪かったりと影響があったりするでしょうか。 素人質問申し訳ありません。 ご教授いただけますと幸いです。どうぞよろしくお願いします。

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