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(無題) 削除/引用 No.1102-18 - 2012/11/06 (火) 10:16:57 - AP googleのイメージ検索をしてみたんですが、 ttp://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/References/Ambion-Tech-Support/microrna-studies/tech-notes/isolating-mirnas-from-pancreatic-samples.html これなんかは(denatured gel)、small RNAというバンドが見えています。RNeasyではふつうsmall RNAは取れてこないと思いますが。 ttp://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/1-10.1007_s10811-009-9433-x-2 これなんかだと(native gel)、条件によって小さいRNAが見えてきているようです。収量が多いとそれによって濃くなっているだけのようにも見えます。 ttp://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mc01d02.html これのfiguresをみると、denature gel, native gel, 分解されたRNAの泳動像が並んでいます。nativeだと18Sの下に太いバンドが見えますね。denaturedだとそれはなくて、代わりにmRNAであろうスメアが見えます。そこから考えると、18 Sの下のバンドは主に高次構造をとったmRNAではないかと推察できます。高次構造の取り具合によって移動度はこれより大きいこともあるでしょう。 結論 手抜きせず、denatured gel電気泳動をやってみるべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1102-17 - 2012/11/05 (月) 23:21:04 - おお 似たようなサンプルで、何度か精製して見ればどうでしょうか。分解であれば分解産物はその都度バンドの強さとか、位置が違ってくるでしょうし(全く同じ程度に分解するのが繰り返せるとはおもえないので)。 300bとかですか。。。あまり強いシグナルは通常でないようです。場合によっては早く進む核酸が先にエチブロを吸収して進むので、あとをおう長い核酸の染り具合が悪くなるケースもあります(乗っける量にもいぞんしますが)。エチブロは単独で核酸と反対方向に進むので多分子のエチブロを含む核酸は流れが遅くなりがちです。 あと染めはできないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1102-16 - 2012/11/05 (月) 23:07:59 - Regard >[Re:15] 直輝さんは書きました : > http://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/Products-and-Services/Applications/PCR/real-time-pcr/qpcr-education/real-time-pcr-troubleshooting-tool/gene-expression-quantitation-troubleshooting/abnormal-amplification-curves/amplification-occurs-later/rna_sample_may_be.html > > このページにある写真のIntactとDegradatedの中間ぐらいになってるんじゃないのかな？ > > 全く分解していないRNAならば、28Sのバンドは18Sのバンドの倍くらい明るいです。 > 28Sの方が分解されやすいので、28Sと18Sの比で分解度が分かるんですが、28Sと18Sが同じくらいの明るさなら、real-time PCRなどに使う分には問題ないと考えている人が多いと思います。 > 28Sのバンドの方が明らかに暗いならば、かなり分解されているので、その点を踏まえてデータ解釈した方がいいですね。 んー…28Sと18Sはほぼ同じ程度なのですが… でも見た感じだと300bp付近のバンドもintactのバンドと似たような光りかたをしているので全く持って謎です 本当に分解産物かといわれると不安が残ります。形として確かに中間のように見えますが、マーカが500bpまでで分解産物が溜まっている場所が今一判らないので確かに同じかといわれたら解らないと答えるしかないと思います。 そもそも殆ど28S,18S rRNAが分解された環境であそこまで暗いバンドになるものなのでしょうか。ばらけているから、という理由なのならばそれはそれで納得もできるのですが…

(無題) 削除/引用 No.1102-15 - 2012/11/05 (月) 22:55:26 - 直輝 http://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/Products-and-Services/Applications/PCR/real-time-pcr/qpcr-education/real-time-pcr-troubleshooting-tool/gene-expression-quantitation-troubleshooting/abnormal-amplification-curves/amplification-occurs-later/rna_sample_may_be.html このページにある写真のIntactとDegradatedの中間ぐらいになってるんじゃないのかな？ 全く分解していないRNAならば、28Sのバンドは18Sのバンドの倍くらい明るいです。 28Sの方が分解されやすいので、28Sと18Sの比で分解度が分かるんですが、28Sと18Sが同じくらいの明るさなら、real-time PCRなどに使う分には問題ないと考えている人が多いと思います。 28Sのバンドの方が明らかに暗いならば、かなり分解されているので、その点を踏まえてデータ解釈した方がいいですね。

(無題) 削除/引用 No.1102-13 - 2012/11/05 (月) 22:46:01 - おお >[Re:12] Regardさんは書きました : > ラダーはDNAラダーを用いています。 ではまずサイズの見積があってないですね。

(無題) 削除/引用 No.1102-12 - 2012/11/05 (月) 22:43:00 - Regard >[Re:9] KENさんは書きました : > 1%アガロースを用い変性させていないとのことですが、マーカーは何を使われているのですか？ > DNA用のラダーですか？RNA用ですか？ > なんだか、分解されたRNAのような気もしますが。。。 > 変性ゲルでやりなおすか、バイオアナライザで測定してみては？ ラダーはDNAラダーを用いています。

(無題) 削除/引用 No.1102-11 - 2012/11/05 (月) 22:41:43 - Regard > へんせいさせないと移動度や、ひかり具合が違うので前にお示ししたリンクのパターンと違ってもおかしくはありませんが。。。 > > サイズはどのようにして確認しているのですか? サイズ確認はラダーで行っています。

(無題) 削除/引用 No.1102-10 - 2012/11/05 (月) 22:36:09 - おお >[Re:8] Regardさんは書きました : > > 励起波長は260nm UVで、撮影は普通のカメラを用いてやって居ます。 > ゲルは1%アガロースでエチブロを0.5μL混ぜて有ります。 > total RNAをアプライしていますが、変性はさせていません。 > へんせいさせないと移動度や、ひかり具合が違うので前にお示ししたリンクのパターンと違ってもおかしくはありませんが。。。 サイズはどのようにして確認しているのですか?

(無題) 削除/引用 No.1102-9 - 2012/11/05 (月) 22:34:56 - KEN 1%アガロースを用い変性させていないとのことですが、マーカーは何を使われているのですか？ DNA用のラダーですか？RNA用ですか？ なんだか、分解されたRNAのような気もしますが。。。 変性ゲルでやりなおすか、バイオアナライザで測定してみては？

(無題) 削除/引用 No.1102-8 - 2012/11/05 (月) 21:46:48 - Regard >[Re:7] APさんは書きました : > 冗談でなくBPBかもしれないで、確認させてください。 > そのバンドはBPBとは区別できるのでしょうか。 > 可視光で見たときのBPBの青いバンドと、紫外線を当てたときの光っているバンドは一致していないですか？　 > > 仰っているバンドサイズ（移動度）はまさにBPBと矛盾しないところです。 > それと、情報として泳動方法(ゲル濃度、変性・未変性など）、観察方法（染色法、励起波長、撮像方法など）があると手がかりになると思います。 励起波長は260nm UVで、撮影は普通のカメラを用いてやって居ます。 ゲルは1%アガロースでエチブロを0.5μL混ぜて有ります。 total RNAをアプライしていますが、変性はさせていません。 因みに可視光での青色とバンドの位置は大きく離れていますので、どうもその説は自分の状況と当てはまらないのではないかと考えております。

(無題) 削除/引用 No.1102-7 - 2012/11/05 (月) 18:31:31 - AP 冗談でなくBPBかもしれないで、確認させてください。 そのバンドはBPBとは区別できるのでしょうか。 可視光で見たときのBPBの青いバンドと、紫外線を当てたときの光っているバンドは一致していないですか？　 仰っているバンドサイズ（移動度）はまさにBPBと矛盾しないところです。 それと、情報として泳動方法(ゲル濃度、変性・未変性など）、観察方法（染色法、励起波長、撮像方法など）があると手がかりになると思います。

(無題) 削除/引用 No.1102-6 - 2012/11/05 (月) 17:14:07 - Regard >[Re:4] おおさんは書きました : > >[Re:3] 直輝さんは書きました : > > 5Sにしてはシグナルが強すぎるかもですね。 > > RNAが分解してるんだと思う… > > 精製法によっても解釈はちがうかのうせいがありますね。私も分解かもとちょっと思いましたが、28sと18sのレシオは見られたんでしょうか。 > > http://www.promega.com/~/media/files/resources/promega%20notes/94/cleanup%20of%20trizol%20reagent-purified%20total%20rna%20using%20the%20pureyield%20rna%20midiprep%20system.pdf?la=en 28sと18sの物は200μL程度の物です。(Fig2) また、5S rRNAとも位置としては異なるようです Fig3でいえば18Sと5.8Sの中間にあるようなバンドが非常に太いのですが…

(無題) 削除/引用 No.1102-5 - 2012/11/05 (月) 10:10:01 - AP BPBだったりして

(無題) 削除/引用 No.1102-4 - 2012/11/05 (月) 01:45:16 - おお >[Re:3] 直輝さんは書きました : > 5Sにしてはシグナルが強すぎるかもですね。 > RNAが分解してるんだと思う… 精製法によっても解釈はちがうかのうせいがありますね。私も分解かもとちょっと思いましたが、28sと18sのレシオは見られたんでしょうか。 http://www.promega.com/~/media/files/resources/promega%20notes/94/cleanup%20of%20trizol%20reagent-purified%20total%20rna%20using%20the%20pureyield%20rna%20midiprep%20system.pdf?la=en

(無題) 削除/引用 No.1102-3 - 2012/11/05 (月) 00:47:41 - 直輝 5Sにしてはシグナルが強すぎるかもですね。 RNAが分解してるんだと思う…

(無題) 削除/引用 No.1102-2 - 2012/11/05 (月) 00:13:09 - おお 5Sかな。

total RNA電気泳動後のバンドの詳細 削除/引用 No.1102-1 - 2012/11/04 (日) 23:05:24 - Regard 最近遺伝子抽出を行い始めたものです。 ラットの肝臓からRNAを抽出してそれを電気泳動に掛けたのですが、2000bp及び5000bp付近に強いバンドが見られたのでこれはrRNAだなと解ったのですが、200〜400bpに更に強いバンドが見られたのですが、これが何かわかりません。 抽出環境はRNeasyの動物用キットで行い、gDNA分解酵素を用いてDNAを分解し、カラムで除去して有ります。 200〜400bpに出てきているバンドが他に出ている方でこの辺りに存在するのが何なのかわかる方、教えてください。宜しくお願いします。

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