Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

complete EDTA free tabletとHRV3C トピック削除
No.11042-TOPIC - 2022/12/15 (木) 16:47:51 - 太郎
大腸菌でGST tagとPreScissionサイトをつけたタンパク質を発現させ、Glutathione sepharoseに結合させた後、オーバーナイト5℃でHRV3Cと反応させて(25mM Tris-Cl, 1mM EDTA, 50mM NaCl)、目的タンパク質を回収しました。

この際、タンパク質が透析前の段階でもやや分解されていました。Lysisの間はPMSFとcOmplete EDTA free tabletを加えていますが、HRV3Cと反応させている間はEDTA以外プロテアーゼインヒビターの類を入れていなかったので、1mM PMSFと1×cOmplete EDTA free tablet (Roche社)を加えたら、収量が大きく低下しました。

PMSFは製品説明を見るとHRV3Cの活性を阻害しないようですが、cOmplete EDTA free tabletはHRV3Cの活性を阻害しますでしょうか？
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.11042-5 - 2022/12/16 (金) 10:27:24 - ああ
精製中の分解とは限らないですよ。
まずは、ライセート段階で分解物がないか確認ください。
分解物が見られる場合で、それが邪魔になる量であれば、
@ある種のプロテアーゼ欠損株を使う。
AN末とC末に別なタグをつけて2段階精製する。
B十分に分子量が離れてるのであればゲル濾過で除く。
という選択肢もあるかと思います。
AはGST 3C Target His or Strepでよくやります。

(無題) 削除/引用
No.11042-4 - 2022/12/16 (金) 06:48:28 - おお
システインプロテアーゼですよね。
とりあえずはしっかりとプロテアーゼ活性をブロックしてカラムに乗っけたあともしばらくはLysateと変わらないぐらいのInhibitorsで洗って（このとき洗い方も少し塩濃度を高くするとか工夫してよりきれいになるようにして）、それからInhibitorsを除いて切断を始めるとベターなのかもしれません。

cOmplete EDTA free tabletはプロテアーゼの作用が強いときは１タブレット/１０mlで使えるという記載がRocheの説明の何処かにあったかと思います。またはバクテリア用のInhibitor mixが売っていますね。

P8465
Sigma-Aldrich
Protease Inhibitor Cocktail powder

Cepham Life Sciences, Inc
Protease Inhibitor Cocktail [100X], Bacterial

G-Biosciences
Bacterial ProteaseArrest™ Protease Inhibitor Cocktail

中身はそんなに変わらないみたいです。
また不可逆的なインヒビターをなるべく使いたいところですがcOmpleteは中身がよくわからないですから困ったもんです。不可逆なものとしてはE64、PMSF、AEBSF（PMSFの上位互換とおもっている）、あと効くかどうかわからないけどTLCKとTPCKなど。

切断時にはHRV-14 3Cに影響のあるものは除かないといけないだろうから、セリンプロテアーゼインヒビターとか影響のなさそうなものを中心に変えるといいでしょう。PMSFはセリンプロテアーゼインヒビターなんですけど、特異的というよりセレクティブで高濃度では他のタイプのプロテアーゼも阻害するような話を聞きましたが、メーカーが大丈夫だと言うならその範囲内でいいのかなと。ただそういう話があるならAEBSFはちょっと反応時には入れたくない。

PMID: 9328292
PMID: 2555433
これもそうかな
https://structbio.vanderbilt.edu/wetlab/private/vectors/3C/Purif.H6H3C.v6.pdf

E64が効果ないのが不思議な感じがしますね。
あと最後のリンクなんですがNaClが０.８ Mでも活性が維持されてというより更に活性化されているようなのでカラムではそこそこ塩濃度を上げて他のプロテアーゼ活性の最適な条件から遠のけるてはありますね。

(無題) 削除/引用
No.11042-3 - 2022/12/15 (木) 17:23:24 - 太郎
おおさん

しますよね。すみません。
PMSFとかLeupeptin存在下でも使えると書いてあったので、いけるかもと思って使っちゃいました。
プロテアーゼを効かしたいという願いと阻害したいという願いを両立させたくて…

(無題) 削除/引用
No.11042-2 - 2022/12/15 (木) 17:16:13 - おお
普通はすると考えますが、しないと思った理由はなんでしょう。

complete EDTA free tabletとHRV3C 削除/引用
No.11042-1 - 2022/12/15 (木) 16:47:51 - 太郎
大腸菌でGST tagとPreScissionサイトをつけたタンパク質を発現させ、Glutathione sepharoseに結合させた後、オーバーナイト5℃でHRV3Cと反応させて(25mM Tris-Cl, 1mM EDTA, 50mM NaCl)、目的タンパク質を回収しました。

この際、タンパク質が透析前の段階でもやや分解されていました。Lysisの間はPMSFとcOmplete EDTA free tabletを加えていますが、HRV3Cと反応させている間はEDTA以外プロテアーゼインヒビターの類を入れていなかったので、1mM PMSFと1×cOmplete EDTA free tablet (Roche社)を加えたら、収量が大きく低下しました。

PMSFは製品説明を見るとHRV3Cの活性を阻害しないようですが、cOmplete EDTA free tabletはHRV3Cの活性を阻害しますでしょうか？
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。