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(無題) 削除/引用 No.11045-7 - 2022/12/17 (土) 16:47:45 - おお >[Re:5] AAさんは書きました : > タカラのmutagenesisはPCR産物をそのまま菌液へ持ち込み、DpnI処理はなかったように思います。 了解です。わたしもかくにんいたしました。プロトコールを見ると、忠実にやるとテンプレートの持ちこみによるコロニーは数個(10pg使用)から数十個(100pg使用)で、生えてきたコロニー数がその範囲ならバックグランドという可能性が高いと思います。 >考え1) >ネガコンの中のplasmidは適切なbuffer中に溶解しているわけではなく、組成は水、プライマー、>plasmidだけです。したがって高温中で失活しやすくなったのではないか。 バッファーだと安定だと言う根拠は何ですか？感覚的にはマグネシウムがあるほうが嫌だなあと思っている。 私は、プライマーを入れてPCRしたサンプルの方が伸長反応により二本鎖が出来るので、プライマーがない場合よりもつれあう事が少ないが、PCRが上手くかかってないためにプライマーから伸長してできたものが不完全でPCRからのプロダクトは形質転換活性がなかったのだと思う。だからバックグランドを拾っただけだった。 ネガコンを置きたいのであれば、別に水とプライマーでいいけどわざわざPCRしなくてもいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.11045-6 - 2022/12/17 (土) 14:46:08 - mutagenesis PCR productをそのまま大腸菌にトランスフォームさせます。ligationしていないのですが、大腸菌の修復機構を用いるようです。 考え1) ネガコンの中のplasmidは適切なbuffer中に溶解しているわけではなく、組成は水、プライマー、plasmidだけです。したがって高温中で失活しやすくなったのではないか。 考え2) ネガコンではコロニーが生えず、目的サンプルでは野生型が生えることから、野生型が増幅しているのではないか。（しかしプライマーは変異が入っています） の2つが考えられますが、考え2はありえないので考え1かと思うのですが、皆さんの経験と知識をお借りして結論を出したいという所存です。

(無題) 削除/引用 No.11045-5 - 2022/12/17 (土) 13:57:25 - AA タカラのmutagenesisはPCR産物をそのまま菌液へ持ち込み、DpnI処理はなかったように思います。

(無題) 削除/引用 No.11045-4 - 2022/12/17 (土) 02:24:52 - おお >[Re:1] mutagenesisさんは書きました : > 逆に、本来ネガコンでも同数生えるはずだったが、PCR solの溶液の組成とPCR中の高温のせいで、plasmidが壊れてしまったためにコロニーが生えなかったと考える方が妥当だと思うのですが、 プラスミドが壊れるなら、PCRプロダクトも壊れて増えないよね。 熱変性で、部分的に構造がもとの状態に戻らないと言うのはあるかもしれないけど。 ところで、この方法ではDnpとかで処理するんでしたっけ？していたら基本どちらもテンプレートは分解しているはずですよね。

(無題) 削除/引用 No.11045-3 - 2022/12/16 (金) 17:49:04 - おお >[Re:2] Karasさんは書きました : > ネガコンで生えない理由は分かりませんが、その方法での変異導入コロニー率を上げる解決策はあるのでそれを書きます。 > > 反応50uL当たりのテンプレート量を100pg-10pgにしてPCRを掛け、産物のうち5uLを電気泳動してみて下さい。 > > 目的とする長さのバンドがハッキリ見えるようにPCR条件を工夫し、綺麗に1本線になるならPCR産物を直接トランスフォームしますし、エキストラバンドが消えなくても目的バンドをゲル抽出してからトランスフォームします。 目的の産物はニックの入った環状のものではないですか？と言うことは、従来のサイズより遥かに高分子のところに来そうですがそうでもないのでしょうか？それともプライマーの末端同士でアニールしている部分を加熱して剥がしてから電気泳動してるのですか？

(無題) 削除/引用 No.11045-2 - 2022/12/16 (金) 16:22:31 - Karas ネガコンで生えない理由は分かりませんが、その方法での変異導入コロニー率を上げる解決策はあるのでそれを書きます。 反応50uL当たりのテンプレート量を100pg-10pgにしてPCRを掛け、産物のうち5uLを電気泳動してみて下さい。 目的とする長さのバンドがハッキリ見えるようにPCR条件を工夫し、綺麗に1本線になるならPCR産物を直接トランスフォームしますし、エキストラバンドが消えなくても目的バンドをゲル抽出してからトランスフォームします。 これでコロニーの9割以上で変異が導入されている筈です。

mutagenesisの際のネガティブコントロール 削除/引用 No.11045-1 - 2022/12/16 (金) 10:36:18 - mutagenesis TakaraのPrimeSTAR Mutagenesis basal kitを用いて、あるタンパク質に変異を導入しようとしています。プラスミドにプライマーとx2 PrimeSTAR Premix maxを加えたものと、ネガコンとしてx2 PrimeSTAR premix maxの代わりに水を加えたものをPCRにかけ、大腸菌をトランスフォーメーションさせました。 すると明らかにPrimeSTAR Premix maxを加えたものではコロニーが増え、加えなかったものではコロニーが生えていませんでしたので、mutagenesisが成功したと見なしてsequenceを解析すると、どれもmutationが入っていませんでした。 最初はもともとのplasmidが増えてしまったのかと考えましたが、ありえませんよね？ 逆に、本来ネガコンでも同数生えるはずだったが、PCR solの溶液の組成とPCR中の高温のせいで、plasmidが壊れてしまったためにコロニーが生えなかったと考える方が妥当だと思うのですが、このような経験はございますか？

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