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(無題) 削除/引用 No.11056-7 - 2022/12/21 (水) 14:58:16 - ゆう その条件のサンプルサイズは2以上ですか？それならどのサンプルも4ずれますか？上がるのですか、下がるのですか？ ＞n=2です。 n=2間ではずれず、条件ごとにずれます。Controlに比べると添加した試薬の濃度に依存していないようにみえます。 以前のデーターでずれなかったとすれば、RTまでの過程で何か起こっていると考えるのが妥当と思いませんか。 >再度RTをしたのですが、改善されずほとんど同じCt値、ずれが出たので他の思いつかない要因があるのかと考えました・・・ そのRNAをエタチンして溶かし直して改善しませんか？ >やってみようと思います

(無題) 削除/引用 No.11056-6 - 2022/12/21 (水) 14:37:07 - おお >[Re:5] ゆうさんは書きました : > 一応ずれる可能性があるから、補正する必要がある訳ですが、、、どの程度ずれますか? > >Ct値が4程ずれます。 > その条件のサンプルサイズは2以上ですか？それならどのサンプルも4ずれますか？上がるのですか、下がるのですか？ 以前のデーターでずれなかったとすれば、RTまでの過程で何か起こっていると考えるのが妥当と思いませんか。 そのRNAをエタチンして溶かし直して改善しませんか？

(無題) 削除/引用 No.11056-5 - 2022/12/21 (水) 13:21:27 - ゆう 一応ずれる可能性があるから、補正する必要がある訳ですが、、、どの程度ずれますか? >Ct値が4程ずれます。 ところで、内部標準決めるために皆さん絶対定量しているのですか？その時の方法論は？ 絶対定量はしていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.11056-4 - 2022/12/21 (水) 13:20:26 - ゆう 絶対量での定量はしていません。 以前のデータから、揃うはずという予測の上での質問でした。

(無題) 削除/引用 No.11056-3 - 2022/12/20 (火) 23:50:38 - おお 一応ずれる可能性があるから、補正する必要がある訳ですが、、、どの程度ずれますか? 原因としては、RTの効率がそろわない(そこがブラックボックスだから補正する)、RNAが壊れている(再度精製が必要、あるいはサンプリングの時点で分解している)、そもそもアクチン自身の発現が変動している。 ところで、内部標準決めるために皆さん絶対定量しているのですか？その時の方法論は？

(無題) 削除/引用 No.11056-2 - 2022/12/20 (火) 19:17:02 - BlueComma 内部標準がサンプル間で異なるのであれば，いわゆる比較Ct法は適用できません。 内部標準として用いられやすいハウスキーピング遺伝子にも色々な特徴があるようなので，御自身の系でサンプル間の変動が小さいものを選択するのがいいと思います。 または，複数のハウスキーピング遺伝子の発現量の幾何平均で補正する方法もあります。 参考： https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/qpcr-basic45/#i ところで，β‐アクチンの発現量が変動するというのは，絶対量の定量で確認されたのでしょうか？

real-timePCRのハウスキーピング遺伝子の発現量について 削除/引用 No.11056-1 - 2022/12/20 (火) 18:08:10 - ゆう こんにちは、大学学部生です。 研究室でリアルタイムPCRを行う実験をしております。 ハウスキーピング遺伝子としてβ-actinを用いているのですが 条件によって発現量がずれてしまいます。 逆転写を再度行っても結果が全く変わらずCt値等もほとんど同じ値を取っています。 ずれている状態で補正を行ってよいものか、それとも人為的ミスでこのようなずれが起こるものなのか・・・ 原因もわからなければ解決策もわからずじまいです。 なにか心当たりがありましたら教えていただけると幸いです。 よろしくお願いいたします。

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