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(無題) 削除/引用 No.11085-19 - 2023/01/02 (月) 20:14:21 - おお >[Re:16] DMSOさんは書きました : > おお様 > > 重ねて、ありがとうございます。 > 核は全体的に染まっていました。 > 小胞体ぽく染まっていたため、膜非透過性にも関わらず細胞内に入ってしまっているのだと思います。 > もしかしたら、膜上のタンパク質とそのビオチン化低分子化合物が相互作用したのち、細胞内にエンドサイトーシスしてしまっているのかもと思っています。 > 膜非透過性でも小胞体には入りますが、、、小胞体である根拠はまだないのですか？ 核がそのように染まるのはちょっと解せないですけど。

(無題) 削除/引用 No.11085-18 - 2023/01/02 (月) 11:32:43 - 1 低温（４℃くらい）でやって見たらどうですか。（反応中だけでなく使用するbuffer類も全て〜４℃にしておく）。問題の原因がエンドサイトーシスによる取り込みならば一応抑制できます。FACSの時、生細胞の表面抗原の標識ではエンドサイトーシスによる抗体や標識物質の細胞内取り込みを抑えるためによく行われます。

(無題) 削除/引用 No.11085-17 - 2023/01/01 (日) 14:07:24 - DMSO toto様 ありがとうございます。 DMSOを溶媒とする試薬は直前に未使用の培地に加え、よくボルテックス後、細胞から古い培地を除き、そこへ加えています。 >[Re:14] totoさんは書きました : > まずないと思いますが、DMSO溶液は培地で希釈したものを細胞に添加されてますよね？もしDMSO溶液1uLを細胞の培地に直接加えれば、局所的に高濃度になるので、まだらに中に入ることもありますが、ないかな。

(無題) 削除/引用 No.11085-16 - 2023/01/01 (日) 14:05:36 - DMSO おお様 重ねて、ありがとうございます。 核は全体的に染まっていました。 小胞体ぽく染まっていたため、膜非透過性にも関わらず細胞内に入ってしまっているのだと思います。 もしかしたら、膜上のタンパク質とそのビオチン化低分子化合物が相互作用したのち、細胞内にエンドサイトーシスしてしまっているのかもと思っています。 >[Re:13] おおさんは書きました : > >[Re:7] DMSOさんは書きました : > > > 細胞染色をすると、核や小胞体などが染まっていました。 > > 小胞体が染まるということは小胞体内にあれば膜は正常で小胞体内から出られないということではないですか？ > > 核はどの部位が染まってますか？小胞体は（直接的、間接的かはおいておいて）核膜とコミュニケーションがあります。 > > >

(無題) 削除/引用 No.11085-15 - 2023/01/01 (日) 14:00:44 - DMSO あの様 私の使用する濃度の半分ですね。 参考になります。ありがとうございます。 >[Re:12] あのさんは書きました : > 一般には次のような考え方ですね > > https://jikken110.com/protocol13.html

(無題) 削除/引用 No.11085-14 - 2023/01/01 (日) 10:32:40 - toto まずないと思いますが、DMSO溶液は培地で希釈したものを細胞に添加されてますよね？もしDMSO溶液1uLを細胞の培地に直接加えれば、局所的に高濃度になるので、まだらに中に入ることもありますが、ないかな。

(無題) 削除/引用 No.11085-13 - 2023/01/01 (日) 06:29:38 - おお >[Re:7] DMSOさんは書きました : > 細胞染色をすると、核や小胞体などが染まっていました。 小胞体が染まるということは小胞体内にあれば膜は正常で小胞体内から出られないということではないですか？ 核はどの部位が染まってますか？小胞体は（直接的、間接的かはおいておいて）核膜とコミュニケーションがあります。

(無題) 削除/引用 No.11085-12 - 2022/12/31 (土) 16:57:20 - あの 一般には次のような考え方ですね https://jikken110.com/protocol13.html

(無題) 削除/引用 No.11085-11 - 2022/12/31 (土) 14:17:34 - DMSO >[Re:6] おおさんは書きました : > 細胞表面が染まっていて、上から見てあたかも細胞の中が染まっているように見えてる可能性はないですか？ > > ほとんどの細胞に低分子が制限なく入るぐらい膜が痛んでいれば、かなりの細胞が死んでいてもおかしくないと思います。 おお様 重ねてありがとうございます。 共焦点で観察しておりますが、やはり細胞内が染まっているようです。 核も明らかに染まっています。 これらのことから、そのビオチン化低分子化合物は生細胞に取り込まれていると考えています。 が、Thermo Fisherのホームページによると、高度にPEG化されているため、membrane impermeableと書かれてあります。 以上の理由から、DMSOが膜の透過性を上げてしまったのかと考えトピを立てさせていただきました。 0.2%ではそれほど影響はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11085-10 - 2022/12/31 (土) 14:14:48 - DMSO >[Re:5] LPSさんは書きました : > 愚問ですが、コントロールはDMSO単独での結果はお持ちなんですよね。 LPS様 ありがとうございます。 はい、DMSO単独の細胞ではストレプトアビジンでは染まっていません。

(無題) 削除/引用 No.11085-9 - 2022/12/31 (土) 14:13:27 - DMSO >[Re:4] あのさんは書きました : > 固定の方法の詳細は何ですか？ > > 4％PFA で固定すると、細胞膜に穴が空いて、細胞内に色々入ることがあります。 > > > それから確実に、次を言える状況ですか？ > 　その細胞は、ビオチンをもっていない あの様 ありがとうございます。 固定はその試薬を加えた後、になります。 つまり生細胞をその薬剤で処理したのち、洗浄し、その後、PFAでの固定です。 PFAでは界面活性剤がなくても膜透過性があがることは存じておりますが、その加えた試薬自身は膜非透過性だと言われているので、理屈的には細胞膜が（膜の透過性がPFAであがっていても）ストレプトアビジンで染まるはずではないかと考えています。 しかし、実際にはそのビオチン化低分子化合物は細胞内に染まっています。 ビタミンHですので、内在性ビオチンは全ての細胞は持っています。 ただ、そのビオチン化低分子化合物で処理していない細胞はストレプトアビジンで染まっていないようにみえるので、ストレプトアビジンはビオチン化低分子化合物を特異的に認識していると考えています。

(無題) 削除/引用 No.11085-8 - 2022/12/31 (土) 14:08:50 - DMSO >[Re:3] 1さんは書きました : > 非透過性ですと書いてるのは元気で生きてる細胞に対して使用した時の話で、死んだ細胞や、細胞膜が傷害受けたような細胞だと普通に細胞内も染まると思う。DMSOはhistoneのアセチル化とか介して遺伝子発現には影響与える場合があるけど、0.2%くらいの濃度で透過性に影響するかと言われると経験的にはあまりないような気がする。 1様 ありがとうございます。 細胞はすべて生きています。 接着細胞で、トリパンブルーで染まる細胞もいないです。 なぜかわからないのですが、細胞に取り込まれてしまっています。

(無題) 削除/引用 No.11085-7 - 2022/12/31 (土) 14:06:55 - DMSO >[Re:2] おおさんは書きました : > エンドサイトーシス、ピノサイトーシスの可能性はないですか？ > その場合エンドソームが染まると思いますが、染色パターンはどんな感じでしょうか？ おお先生、 ありがとうございます。 細胞染色をすると、核や小胞体などが染まっていました。

(無題) 削除/引用 No.11085-6 - 2022/12/31 (土) 06:57:26 - おお 細胞表面が染まっていて、上から見てあたかも細胞の中が染まっているように見えてる可能性はないですか？ ほとんどの細胞に低分子が制限なく入るぐらい膜が痛んでいれば、かなりの細胞が死んでいてもおかしくないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11085-5 - 2022/12/31 (土) 04:31:38 - LPS 愚問ですが、コントロールはDMSO単独での結果はお持ちなんですよね。

(無題) 削除/引用 No.11085-4 - 2022/12/31 (土) 03:16:08 - あの 固定の方法の詳細は何ですか？ 4％PFA で固定すると、細胞膜に穴が空いて、細胞内に色々入ることがあります。 それから確実に、次を言える状況ですか？ 　その細胞は、ビオチンをもっていない

(無題) 削除/引用 No.11085-3 - 2022/12/30 (金) 23:50:03 - 1 非透過性ですと書いてるのは元気で生きてる細胞に対して使用した時の話で、死んだ細胞や、細胞膜が傷害受けたような細胞だと普通に細胞内も染まると思う。DMSOはhistoneのアセチル化とか介して遺伝子発現には影響与える場合があるけど、0.2%くらいの濃度で透過性に影響するかと言われると経験的にはあまりないような気がする。

(無題) 削除/引用 No.11085-2 - 2022/12/30 (金) 11:46:23 - おお エンドサイトーシス、ピノサイトーシスの可能性はないですか？ その場合エンドソームが染まると思いますが、染色パターンはどんな感じでしょうか？

細胞へのDMSO効果について 削除/引用 No.11085-1 - 2022/12/30 (金) 11:31:47 - DMSO 質問させてください。 細胞へのDMSO効果についてお聞きしたいです。 ある薬剤をDMSOを溶媒として溶解し、その500分の1量を培養細胞のいる培地に加えました。 その薬剤は細胞膜非透過性とうたわれているビオチン化低分子薬剤です。 ところが細胞をdish上で洗浄し、固定後に染めると細胞内がstreptavidinで染まっていました。 薬剤処理していない細胞では染まらないため、その薬剤が細胞内に入っているのだと思います。 非透過性であることを望んで購入したもののため、どうにかそれを再現できたらと思います。 そこで一つの考えは、DMSOが細胞膜の透過性を上げてしまっている可能性を考えています。 培地500 ulに対して、1 ulの薬剤入りDMSOを加えていますが、許容量を超えていますでしょうか？ 御知恵をお借りできれば幸いです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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