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(無題) 削除/引用 No.11088-6 - 2023/01/02 (月) 11:26:34 - 1 コントロールとして対象タンパク質に対する抗体の代わりにnormal IgG もしくはnon-related 抗体をコンジュゲートしたビーズで、同じライザートからIPをおこなって比較していますか(ていうかIP実験ではこれは必要です）。

(無題) 削除/引用 No.11088-5 - 2023/01/01 (日) 17:54:27 - zam >[Re:4] きつ山さんは書きました : > 上記のように2-MEを使用していましたが、DTTの方がよいなどのご経験はありますでしょうか。 一般論としては2-MEで問題ありません（2-MEの保存状態が悪くて酸化してしまっているならば問題ですが、普通はそんなことはなさらないでしょうし）。 変性還元状態の電気泳動では、非共有結合で会合したタンパク質ならば、解離されてしまうと思います。 二量体化されていると仮定するならば、生理的もしくは非生理的に、モノマー同士が共有結合しているという仮説を立てる必要があるかと思いますが。 たとえばリジン側鎖とグルタミン酸側鎖でイソペプチド結合が生じているといったような。 高分子側に移動したバンドがブロードであれば、非特異的な凝集が起こったことが推定されますが、割と鮮明なバンドであるならば、凝集とも考えにくいですね。 絶対に凝集ではないとは言い切れませんが、凝集以外の可能性も想定した方がよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11088-4 - 2023/01/01 (日) 13:58:46 - きつ山 先生方 年末年始にも関わらず、コメント頂きまして誠にありがとうございます。 おお 先生 ＞具体的に最初のIPで抗体に結合するそのタンパクを遊離させるのにどんな方法をとっていますか？ 還元剤を加えた1xSDS sample buffer 40uL程度を加えてビーズを95C, 10min boilして溶出していました。還元剤は2-MEを使用しており、終濃度700mM程度で用いています。 ＞FLAGでやった系で、FLAGタグしたタンパクを発現してないサンプルでもそのバンドが見れますか？ すみません、これは見ておりませんでした。一度確認してみます。 ＞特に疏水性の強い膜タンパクだと変性したり極端な条件に晒したりする事でアグってしまう可能性はあると思います。 ＞アグっている場合、IPしたビーズを8M ureaにDTTとBPBを加えたサンプルバッファーでそのタンパク質を遊離させて(熱はくわえずに、加えるとタンパクがurea 副産物と反応する)、SDSPAGEに流したらどうでしょう。 貴重なご意見を誠にありがとうございます。 400-450kDaというのはおおざっぱな推定であり、二量体というよりかは単に凝集したものが非常に分子量の大きな位置に出ているだけ、という可能性が高そうです。ご指摘の溶出方法でやってみようと思います。 Zam 先生 ありがとうございます。 上記のように2-MEを使用していましたが、DTTの方がよいなどのご経験はありますでしょうか。 引き続き、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.11088-3 - 2023/01/01 (日) 12:24:19 - zam 還元剤は使っていますか？

(無題) 削除/引用 No.11088-2 - 2022/12/31 (土) 21:53:22 - おお >[Re:1] きつ山さんは書きました : > いつもこの掲示板で勉強させて頂いております大学院生です。 > 免疫沈降法のトラブルシューティングのご相談です。 > > 400-450kDa程度のところにバンドが出てしまい、本来の200kDaのところのバンドは相対的にかなり薄くなってしまいます。 > > IPサンプル調整中のテクニカルな問題だとは思うのですが…。 > > 上記はDynabeadsを用いて内因性の目的タンパク質に対してIPを行っておりましたが、 具体的に最初のIPで抗体に結合するそのタンパクを遊離させるのにどんな方法をとっていますか？ FLAGでやった系で、FLAGタグしたタンパクを発現してないサンプルでもそのバンドが見れますか？ > この状況で肝心の翻訳後修飾の評価もなかなか難しく、困 > IPサンプルのメインのバンドはだいたい本来のバンドの2倍程度の分子量の位置ですが、IPサンプルの調整中に2量体を形成してしまう...、などの可能性はあるのでしょうか？ あると思います。特に疏水性の強い膜タンパクだと変性したり極端な条件に晒したりする事でアグってしまう可能性はあると思います。 > > もしお心当たりやご経験がおありの先生がいらっしゃいましたら、是非アドバイスを頂けますと幸いです。 > アグっている場合、IPしたビーズを8M ureaにDTTとBPBを加えたサンプルバッファーでそのタンパク質を遊離させて(熱はくわえずに、加えるとタンパクがurea 副産物と反応する)、SDSPAGEに流したらどうでしょう。

免疫沈降法で予想より2倍程度高い位置にバンドが出てしまう 削除/引用 No.11088-1 - 2022/12/31 (土) 11:25:04 - きつ山 いつもこの掲示板で勉強させて頂いております大学院生です。 免疫沈降法のトラブルシューティングのご相談です。 ある200kDa程度のタンパク質における翻訳後修飾を調べる目的で、このタンパク質に対する抗体を使用して免疫沈降法（IP）を行っております。ところが、IPしたサンプルで再度IPに用いた抗体でウエスタンブロットを行うと、400-450kDa程度のところにバンドが出てしまい、本来の200kDaのところのバンドは相対的にかなり薄くなってしまいます。 Inputでは本来の200kDaのところにバンドが出ており、この400-450kDaのバンドは出ません。ので、IPサンプル調整中のテクニカルな問題だとは思うのですが…。 上記はDynabeadsを用いて内因性の目的タンパク質に対してIPを行っておりましたが、FLAGタグ付きの目的タンパク質を強制発現させてFLAGに対する抗体でIPを行っても、ほぼ同様の結果になってしまいました。 また、RIPAバッファーで普通にライセートを作ってIPをしても、1%SDSで変性後に10倍程度に薄めて変性後IPを行ってもほぼ同様の結果になってしまいま した。この状況で肝心の翻訳後修飾の評価もなかなか難しく、困っております。 IPサンプルのメインのバンドはだいたい本来のバンドの2倍程度の分子量の位置ですが、IPサンプルの調整中に2量体を形成してしまう...、などの可能性はあるのでしょうか？ もしお心当たりやご経験がおありの先生がいらっしゃいましたら、是非アドバイスを頂けますと幸いです。 年末のお忙しい時期に申し訳ありません。 何卒宜しくお願い致します。

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