全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11097-5 - 2023/01/09 (月) 11:52:42 - ままま みなさま ご回答頂き誠にありがとうございます。 やはりスケールを大きくするのが一番効率的な解決策なのですね。 現在研究室にStbl3しか持ち合わせていないため、Stbl3を使用していましたが、toto様のおっしゃるように別のStblを使って再度挑戦してみようと思います。 非常に参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.11097-4 - 2023/01/08 (日) 10:17:17 - Karas 同じ問題に当たったことがありますが、有効な解決策はスケールアップする事だけでした。50mLや100mLといった中途半端なレベルでは結局ウイルス作成に必要な収量が取れず、1Lスケールで大腸菌を増やして何とかなりました。

(無題) 削除/引用 No.11097-3 - 2023/01/06 (金) 20:15:51 - toto 菌体を変えてみることをお勧めします。レンチはstbl２でやってますが、特に問題なくとれてます。近隣から別のコンピをもらって片端から試されてはどうでしょうか。特にstbl3にこだわる必要もないでしょう。メーカーの話はあんまりあてになりません。

(無題) 削除/引用 No.11097-2 - 2023/01/06 (金) 20:00:31 - G25 Scale upに尽きる。 組み込んだ遺伝子のleaky expressionが宿主に毒性である場合の典型てきなパターンでしょう。少ないにしろ収量があるだけめっけもんです。そもそも毒性のために形質転換体のコロニーが生えてこなかったり（ようやく生えたと思っていたらコンストラクトが変異を起こしていたり）ということも多い。 そんな最悪の自体ではなく、収量が不十分というだけならだまってScale upしたらよろしい。miniprepでしかやっていないようなので、伸びしろは十分です。 毒性のため死んでしまったり増え難かったりする場合には、培養温度を下げたりします。これは、pUC系の高コピーベクターの場合、コピー数が1/10くらいに減ることでレスキューされるのです。当然、プラスミドの収量は減ります。 あなたのケースでは、温度を下げると今取れている収量より更に下がってしまうだけになりそうです。pUC系レプリコンでないベクターだと、温度を下げることでいくぶんかは、leaky expression自体が抑えられ、収量が上がるかもしれませんが。 レンチウイルスベクターのLTRのように長い反復配列があると組換えが起こりやすいなどでプラスミドの安定性が悪いので、StblシリーズやStableなんかが推奨されます。

レンチウイルス用プラスミド収率が低い 削除/引用 No.11097-1 - 2023/01/06 (金) 17:31:16 - ままま いつも参考にさせて頂いています。 現在、レンチウイルス発現プラスミドを作成し、大腸菌を使ってプラスミドの増幅・回収をしているのですが、収率が5ng/ulのようにかなり低くなってしまっています。 具体的に言うと、同様の手順で大腸菌からプラスミドを回収したにも関わらず、コロニーサンプル毎に収率が低かったり高かったりするのです。制限酵素で確認したところ、収率の低いプラスミドは目的のレンチウイルスプラスミドで、収率の高いプラスミドは目的では無いプラスミドであることが分かりました。 このことから、レンチウイルス発現プラスミドは収率が低くなりやすいのかなと思いました。似たような経験をお持ちの方はいらっしゃいますか？回収率を上げる解決策があれば教えていただきたいです。 なお、 形質転換に使用しているコンピテントセルは Stbl3 です。レンチウイルスを増幅する際に適しているらしく使用しています。 プラスミドは、コロニーをピックアップして抗生物質を含む3mlの培地で一晩ゆらし、十分に大腸菌が増幅したところで回収を開始しています。NucleoSpin Plasmid EasyPureを使用しています。 どうぞよろしくお願いいたします。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---