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(無題) 削除/引用 No.11105-22 - 2023/01/17 (火) 18:31:04 - momo モノクロなので特異性がM2と共通かどうかはわかりません。ポジコンも同じタグだということなので、トリビアルな間違いでなければ感度の問題ではないかと。

(無題) 削除/引用 No.11105-21 - 2023/01/17 (火) 18:27:04 - G25 CST#14793については情報がないですけど、Mab Anti-FLAG M2 では、抗原決定基はDYKxxDであって、それ以外のアミノ酸残基は入れ替え可能で必ずしもDYKDDDDKである必要はありません。そして3xFLAGはDYKxxDを守っています。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23807489/ 第一、仮に3xのうち一つしか抗体に認識されないとしても、まったく検出できないということは考えにくいし、ポジコンの3xFLAG融合タンパク質が検出できてるというのだから、使用している抗体と3xFLAの組合せが悪いということはないわけですね。

(無題) 削除/引用 No.11105-20 - 2023/01/17 (火) 09:28:56 - momo だとすると感度の問題ではないかと思います。ポジコンと量（モル数）は同程度なのに検出できないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11105-19 - 2023/01/16 (月) 22:39:51 - うがっつ >3xFLAGとのことですが、No.11105-1を翻訳するとDYKDDDDKになっているのは3つ目だけで、最初の2つは配列が異なっているようです。モノクロなので最初の2つは認識されていない可能性があります。お使いのポジコンも「コザック-ATG-この3xFLAG配列-BamHI-GST-他のcDNA」という構造をしているのですか？ これに関しては同じ構造をしていますね。

(無題) 削除/引用 No.11105-18 - 2023/01/13 (金) 09:29:11 - noname そういえばタンパク質の回収はどのようにされていますか？ ちょっと手間にはなりますが、GSTで釣ってみるのも確認にはなるかと思いまして。

(無題) 削除/引用 No.11105-17 - 2023/01/13 (金) 07:55:09 - momo 「モノクロなので」というのはおかしかったですね。ここはスルーしてください。

(無題) 削除/引用 No.11105-16 - 2023/01/13 (金) 07:53:47 - momo CST#14793はポリクロじゃなくてモノクロですね。 3xFLAGとのことですが、No.11105-1を翻訳するとDYKDDDDKになっているのは3つ目だけで、最初の2つは配列が異なっているようです。モノクロなので最初の2つは認識されていない可能性があります。お使いのポジコンも「コザック-ATG-この3xFLAG配列-BamHI-GST-他のcDNA」という構造をしているのですか？

(無題) 削除/引用 No.11105-15 - 2023/01/13 (金) 02:43:21 - おお FLAGのフレームがズレているとか、、、FLAGもGSTもフレームズレていてもストップ入らなさそうだし、、、

(無題) 削除/引用 No.11105-14 - 2023/01/12 (木) 22:44:52 - うがっつ その通りです。 サイズが大きくなっているので融合タンパク質にはなっています。 内在性の発現レベルは低くGFPを強制発現させた293TではGeneXに対する抗体で検出できません。

(無題) 削除/引用 No.11105-13 - 2023/01/12 (木) 22:43:23 - うがっつ 抗体はCST#14793 rabbit polyclonalです。 ポジコンで別の蛋白質を発現させたものを流していますが、WBでちゃんと検出できています。

(無題) 削除/引用 No.11105-12 - 2023/01/12 (木) 21:19:02 - み >[Re:11] じさんは書きました : > Gene X のコードする蛋白質は、内在性蛋白質としてその細胞ではすでに発現しているものですか。それとも元々その細胞には発現していない蛋白質ですか。ていうのが、WBで検出したのは内在性のものということではないのかなと思ったので。 GST融合されたら25kDaくらい大きいサイズになるし内在蛋白と区別できるよね

(無題) 削除/引用 No.11105-11 - 2023/01/12 (木) 20:27:16 - じ Gene X のコードする蛋白質は、内在性蛋白質としてその細胞ではすでに発現しているものですか。それとも元々その細胞には発現していない蛋白質ですか。ていうのが、WBで検出したのは内在性のものということではないのかなと思ったので。 もしそうならば、単に導入した遺伝子がうまく発現できていないというだけということではなくて？

(無題) 削除/引用 No.11105-10 - 2023/01/12 (木) 16:51:18 - momo 抗FLAG抗体は具体的にはどの製品をお使いですか？

(無題) 削除/引用 No.11105-9 - 2023/01/12 (木) 13:59:45 - うがっつ シークエンス配列についても確認しました。 デザイン通りの配列になっており、 gccaccATG -3xFLAG-GST -geneX でフレームについてもあっておりました。

(無題) 削除/引用 No.11105-8 - 2023/01/12 (木) 12:21:33 - じ コンストラクトのシーケンスしてflagの配列が本当に入ってるかどうか、配列が間違ってないかどうか確認してみましょう。

(無題) 削除/引用 No.11105-7 - 2023/01/12 (木) 11:56:51 - おお いや、他の抗体で検出できてるんだから、その2-MEは関係ないはずですよ。

(無題) 削除/引用 No.11105-6 - 2023/01/12 (木) 10:38:30 - うがっつ すいません。 情報が誤っておりました。 下記が正しいものです。 コザック-ATG-3xFLAG-BamHI-GST-geneX 5xDyeに2-MEが入っていないのですが、どうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11105-5 - 2023/01/12 (木) 00:13:09 - おお コザックATG -3xFLAG-GST -geneX でないとFLAGタグのタンパクが翻訳されません。お示しの構成ではFLAGタグの後から翻訳が始まっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.11105-4 - 2023/01/11 (水) 23:26:34 - 774 コザックよりATGの位置が問題かと。

(無題) 削除/引用 No.11105-3 - 2023/01/11 (水) 23:18:51 - PPP コザックは3xFLAGの前に入れるべきでは？？？

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