Bio Technical フォーラム

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Stableがうまく作れない トピック削除
No.11129-TOPIC - 2023/01/20 (金) 00:53:21 - 55
Flagタグ付きのタンパク質を強制発現させた培養細胞の中に、全く発現していない細胞がかなりのポピュレーションで存在していることが分かりました。

検討したのですが、抗生剤セレクションでは除外は難しいようです。細胞質に局在するタンパク質ですが、生きたままflowでpositive cellのみ分けることは難しでしょうか。
 
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(無題) 削除/引用
No.11129-2 - 2023/01/20 (金) 03:04:04 - おお
その発現でなにか表面抗原の発現が劇的に変わるなら可能性があると思いますけどね。あるいは形態などがかわってファクスで使える光学的パラメーターがかわるとか。

それより、もっと単純なのは限界希釈で、96Wellに一個の細胞が入るぐらいの濃度でまいて、一個入っているか顕微鏡で確認して、そのWellで増えてきた細胞を回収して発現したものを選ぶとか、10cmのDishに100個ぐらいまいて発現しているクローンを拾うとか。

またはIRES-GFPなどのコンストラクトを新たに作りソーティングするとか(それでも目的のものが発現している割合は100%ではないかもしれない)。

Stableがうまく作れない 削除/引用
No.11129-1 - 2023/01/20 (金) 00:53:21 - 55
Flagタグ付きのタンパク質を強制発現させた培養細胞の中に、全く発現していない細胞がかなりのポピュレーションで存在していることが分かりました。

検討したのですが、抗生剤セレクションでは除外は難しいようです。細胞質に局在するタンパク質ですが、生きたままflowでpositive cellのみ分けることは難しでしょうか。

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