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(無題) 削除/引用 No.1122-4 - 2012/11/09 (金) 20:08:18 - KEN まずは、他のかたもおっしゃられるように、純度の高いアガロースを用いるのが良いかと。 ダメだったら、アクリルアミドゲルを用いるのはどうでしょうか？ ただ、600bpと200bpをそれぞれ切り分けることなら、アガロースで十分だと思いますが。。。 600bpから200bpが出てきたというのは、どのような方法で確認されたのでしょうか？切り出したものをPCRにかけたということでしたら、ブレードを変えてもコンタミは避けれません。精製後、そのままシークエンス反応にかけるのであれば、問題なくかかると思うのですが。。。(EtBrで目視できない程度のコンタミならば、シークエンスは問題なくかかるかと思います。) また、600bpの中から200bpをどけたいだけでしたら、ゲル切り出し後、カラム精製してしまうのが早いかなと。

(無題) 削除/引用 No.1122-3 - 2012/11/08 (木) 10:33:37 - AP 小さいサイズの断片が先に通ったところを、より大きなサイズの断片が通るので、先行する断片が若干大きな断片に混じってくることはあります。 ひとつの原因は、DNAのアガロースゲルへのDNAの吸着です。品質の高いアガロースを使っていればそれほど問題にはならないと思いますが、古くは、yeat tRNAやpoly dI:dCなどを先に流すか、サンプルに混ぜて流して吸着性をブロックして泳動して切り出すという方法もありました。 もうひとつは、バンドのスマイリングです。特にグリセロールなど粘性の高いローディングバッファーを使うと、メニスカスが深くなりウェルの側面にそってサンプルが盛り上がるため、バンドの両端が尾を引きやすくなります。ショ糖液など粘性の低いローディングバッファーを使うことで改善できます。 厚すぎるゲル、泳動時のゲルの傾きは分離を悪くします。 最後に、全部まとめてプラスミドベクターにライゲーションして、クローンとして単離するのはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.1122-2 - 2012/11/08 (木) 07:44:16 - おお 例えば実際は2種類しかないけど、その2種類の配列のDNAがへテロになってアニーリングしてしまって、いろんなサイズに散らばってしまってるのかもしれません。 一度ディネーチャーしてゆっくり温度を下げるとかすると完全な2本鎖の割合が増えるかもしれません。 一層のことですから、予想されるアイソフォームに特異的なプライマーなどを作ったりして、どのエクソンが挿入されているかなど確認していくのもてかもしれません。

アガロースゲルによるDNAの単離ga 削除/引用 No.1122-1 - 2012/11/08 (木) 06:37:17 - cd よろしくお願いします。 とある遺伝子の発現を確認するためにPCRを行ったところ、予定(200bp)よりも大きいサイズのバンドが複数(300、350、400、600bp等)見られました。データベースを確認したところ、どうやらこのPCRに使ったプライマーが認識する二つのエクソンの間に別のエクソンが複数入り込む形のスプライシングバリアントが存在する可能性があることがわかりました。 そこで、これら複数バンドの配列を知るためにPCR産物のアガロースゲル電気泳動から各バンドの切出しを行ったのですが、バンドの単離がうまくいきません。 大きいサイズから順にきれいにバンドを切ったつもりだったのですが、各サイズ相当のゲル断片から抽出したDNAが、別のサイズのDNAを含んでしまうのです。隣合ったサイズのものばかりでなく、すべてのサイズのDNAです。 これが、例えば300bpのはずのところから300bpと350bpのバンドがみられた、であればわかるのですが、600bpのはずのDNAから200bpのDNAまでもが確認できてしまうのです。 このような、DNAの単離がうまくいかない理由に心当りがある方おられますか?切出しの際にコンタミを防ぐ目的でブレードの交換を一々行ったりもしたのですが、うまくいきませんでした。 複数回試みたところ、300bpのバンドだけキレイに切り出せたときがあり、これはシークエンスもうまくいって、新規のエクソンであることがわかりました。

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