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(無題) 削除/引用 No.11285-9 - 2023/03/24 (金) 11:30:59 - G25 >ウエスタンで使用する細胞数10^6個程度はわかりますが、シーケンスではどのくらいの細胞数からDNAを抽出すればよいでしょうか？ 極端な話、コロニーPCRみたいに爪楊枝の先に付着した程度でもいけるでしょう。ちゃんとDNAを精製する必要もなく、PCR反応液中で自然にlysisしたくらいでもいけるんじゃないかな。私は、Chelex-100で処理したlysate上清を使うことが多いですけど。 ただし単一クローンのなかのheterozygosityを見るだけでなく、確立したcell lineんのclonalityも評価するなら、バイアスがかかりにくいようにある程度、細胞数は多くしたほうが良いかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11285-8 - 2023/03/24 (金) 11:00:14 - AA "Tide"とか"ICE"とかのアルゴリズムを使うと、PCR産物を直接読んだシークエンス結果をリファレンス波形と比較してどういう変異由来の産物がどういう比率で入っているのか調べることができます。 クローニング前のごちゃ混ぜ状態で使うことを前提にしているので、単一クローンで2アリルないし異数化して数アリル程度の混ざり具合ならかなり正確に結果が帰ってくると思います。 個人的にはICEがオススメです。(DOI: 10.1089/crispr.2021.0113) KOの評価としてはタンパク質レベルでの解析が不可欠だと思いますが、同時にゲノム編集の結果をきちんと示す必要もあるので、シークエンスデータもあるにこしたことはないと思います。 (データが論文全体の中でどの程度の比重なのかにもよりますが) シークエンス解析用の細胞数はそんなにたくさんいらないと思います。 胚盤胞期胚1個(細胞数数百個くらい？)からシークエンスすることだってありますし、世の中には1細胞からゲノムを取るためのキットもあります。 エタ沈のときにペレットが見えん、ということであれば96ウェル1個ぶんくらいあればいいんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11285-7 - 2023/03/24 (金) 10:29:04 - ゆう 皆様ご回答ありがとうございます。 シーケンスはあくまで補助的で行って、選別に関してはウエスタンでしたいと思います。 あとすみません、細胞数に関する質問ですが、質問の仕方がおかしかったです。 ウエスタンで使用する細胞数10^6個程度はわかりますが、シーケンスではどのくらいの細胞数からDNAを抽出すればよいでしょうか？ リアルタイムPCRは経験ありますが、それと同程度と考えてよいでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11285-6 - 2023/03/23 (木) 02:46:24 - おお >何でタンパク質の発現が検出できないのですか？ゲノム編集されてるからですか？ 目的がノックアウトで、その遺伝子の機能（通常タンパク質によって機能が発揮される）をつぶすことだから、タンパク質が発現してないクローンを拾えばいいということです。逆にゲノムにIn delが入っていてもフレームがシフトしてタンパク質が発現しているなら、その遺伝子の機能が維持されている（ノックアウトされてない）可能性が高いので、実験には使わないでしょう。ただしNon codingとか、たんぱく発現の機能以外をつぶしたいなら話は違ってくるけど。 ２コピーあって何個拾えばいいかということなら、コインの裏表のP値を計算するのと一緒で、５こ拾えばP値は0.03125で３０回に一回ぐらいはすべて同じものを拾ってしまうぐらいの確率。片方にバイアスがかかる可能性と、もうすこしP値を厳しくとったほうが安心ということを考慮に入れるとまあ１０個ぐらいはあったほうがいいかなと思う。 ゲノムからPCRしてそのまま配列を読んで重なった配列と元の配列を照らし合わせて両アレルの配列を抽出するようなソフト（アルゴリズム）とかなかったっけ。ゆっくりと目で追っても大抵わかるとも思えるが。

(無題) 削除/引用 No.11285-5 - 2023/03/23 (木) 02:03:57 - ::: 何でタンパク質の発現が検出できないのですか？ゲノム編集されてるからですか？本当にゲノム編集されてますか？という事に答えるためはやはりゲノム配列の解析は必要でしょう。 High fidelityで今のところ最低７個ぐらいクローニングして７クローン中何クローンが編集された配列でしたって示してある論文は見ました。10クローンを目指して減ってるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.11285-4 - 2023/03/21 (火) 18:02:55 - 独り言 そもそもですが、CRISPRでのKOを、シークエンスや、endonucleaseアッセイなどで選別するのは大変なので、内在性抗体でウェスタンしてます。 今の時代、大抵の抗体は、探せば売っているし、もしくは外注で抗体作成が５，６万円でもできますし。

(無題) 削除/引用 No.11285-3 - 2023/03/21 (火) 16:20:58 - ゆう G25様 ご回答ありがとうございます。 1，2とも理解できました。 2はTAクローニングベクターがあるので、そちらで試してみたいと思います。 ちなみにシーケンスする際の細胞数は一般的にはどのくらいあれば解析できるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11285-2 - 2023/03/21 (火) 15:20:52 - G25 1. 同じin-delをもつホモ接合体になるのは容易に起こりえます。二重鎖切断の多くは相同組換え修復されます。一個目のアリルがNHRJで変異が起こり、残りのアリルにDSBが生じたとき変異を持った一個目のアリルで相同組換え修復されれば同じ変異のホモ接合になります。 なお、培養細胞の核型、ploidyはかならずしも2nではない（倍数性や異数性がザラ）ですが、同じことです。 2. これは好みの問題かなあ。別に高正確性でなくても構わないと思うけど。 まずはやりやすいと思う方でやったら良いんじゃないですか。結果、正確性なんか問題にならないほどの明瞭な変異であればそれでよし、もし、判断に迷う微妙な変異だったら（例えばin-delじゃなくて塩基置換とか）、高正確性酵素で追試することを考えれば。

ノックアウト細胞株の作製について 削除/引用 No.11285-1 - 2023/03/21 (火) 14:56:26 - ゆう CRISPR/Cas9によるノックアウト細胞株について質問です。 ノックアウト後に限界希釈し単一クローンを単離し、シーケンス解析予定です。 １．全く同じインデルが遺伝子の両コピーに生じることというのはあるのでしょうか？その場合ホモ接合KOとなるかと思いますが、ランダムに切断されるから全く同じ切れ方される可能性は低いのかなと思いました。 ２．遺伝子の2コピーがヘテロ接合の場合、抽出したDNAのノックアウト部位を挟むようにPCR増幅してサブクローニングする予定です。その場合はやはり正確に読むようにHigh fidelityのPCR酵素を使用してTOPOクローニングでしょうか？高いのでTAクローニングの方がいいのですが、やはり正確性重視にした方がよいでしょうか？ よろしくお願いします。

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