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(無題) 削除/引用 No.11301-8 - 2023/03/26 (日) 06:41:43 - おお >[Re:7] 1さんは書きました : > 蛋白質がN末側でプロセシングされるやつとかで、前駆体ではflag tagついてるけど成熟型はfalg tagを含めて切り出されたあとなのですでにtagはないとか。そのタンパク質ですが、前駆体から成熟型のやつとか、膜タンパク質とか、ミトコンドリアなどオルガネラへの局在とかじゃないですか。 N末のシグナルペプチドなどのまえにFLAGを付けて、シグナルペプチドが働くものなのだろうか。ぎゃくにプロセッシングさえされずに、FLAG抗体で検出されてしまいそうだが。 いずれにせよ、FLAGタグがついてるポジコンが欲しいところ。Aの抗体はウサギですか？それなら2次抗体が共通しているので疑う余地は殆どないですが、種が違うなら2次抗体がワークしているかも確認できているか、またはする事も必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11301-7 - 2023/03/25 (土) 17:54:51 - 1 Flag抗体が失活してるとか（これが一番ありかなと。）、コンストラクトのFlagの設計とか配列とか何か間違えてるとか、蛋白質がN末側でプロセシングされるやつとかで、前駆体ではflag tagついてるけど成熟型はfalg tagを含めて切り出されたあとなのですでにtagはないとか。そのタンパク質ですが、前駆体から成熟型のやつとか、膜タンパク質とか、ミトコンドリアなどオルガネラへの局在とかじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.11301-6 - 2023/03/25 (土) 17:33:57 - ぱん 皆様ご意見頂きありがとうございます。 コントロールベクターをtransfectionしたものと比較しているので、タンパク質Aの発現はあがっています。 またこのタンパク質はガン細胞でみられる融合タンパクなので内在性には発現していません。 サンプルはtransfection24時間後に回収しています。

(無題) 削除/引用 No.11301-5 - 2023/03/25 (土) 09:42:04 - み A抗体では検出できたと言っているけど非トランスフェクトと比較して発現量は増加しているのかな。内在性だけを検出しているだけとか。 FLAG抗体で細胞染色もしてみたら良いでしょう。トランスフェクション効率が悪くても染色なら発現細胞をみつけられる。もちろん非トランスフェクトの対照も取って下さい。

(無題) 削除/引用 No.11301-4 - 2023/03/25 (土) 08:12:43 - たこ助 transientに出てることを確認するのが１番はじめにやることかと思います。 Endogenousに出てるAのみ検出されていて、fusionは出ていない(トランスフェクション効率が悪いか、なんらかの理由で発現が消失してしまった)んじゃないかと想像しています。 今解析している細胞はトランスフェクション後どのくらいたった細胞なんだろう

(無題) 削除/引用 No.11301-3 - 2023/03/25 (土) 01:19:24 - おお 通常のSDSPAGE -WBであれば構造的にタグが隠れたりと言うのは当てはまりません。よって、指摘の1、2、3は今回はあまり関係がないでしょう。 トランスフェクションはうまくいっているでしょうか？Aに対する抗体で、発現させてない細胞と比べて、発現が増えていたりするのが確認できますか？

AIに聞いてみよう 削除/引用 No.11301-2 - 2023/03/24 (金) 21:36:23 - ChatGPT FLAGタグは典型的には非常に強力な抗体によって検出されますが、いくつかの理由から抗体による検出が難しい場合があります。以下は、FLAGタグが抗体によって検出できなかった可能性がある理由です。 1. タグの配置：FLAGタグはN末端に付加されていますが、この配置によって抗体の認識が妨げられることがあります。タグがタンパク質の内側に埋まっていたり、他の領域と重複していたりする場合、抗体がタグを認識することができません。 2. タグの折りたたみ：タグが折りたたまれている場合、抗体がタグを認識するのが難しい場合があります。 3. タグの遮蔽：タンパク質の他の領域や他のタンパク質によってタグが隠れてしまう場合、抗体がタグを認識することができなくなります。 4. 抗体の特異性：抗体がタグに対して十分に特異的でない場合、非特異的な反応を引き起こし、バックグラウンドノイズが生じる場合があります。また、抗体がタグの一部を認識しない場合もあります。 これらの理由のいずれかが、FLAGタグを検出できなかった原因である可能性があります。しかし、目的のタンパク質Aに対する抗体で検出できたことから、タンパク質A自体は正常に発現していることがわかります。

FLAGをWBで検出できない 削除/引用 No.11301-1 - 2023/03/24 (金) 19:19:19 - ぱん あるタンパク質A（135kDa）のN端にFLAGタグを付加したFLAG-タンパク質Aを作成しました。それをHEK293細胞に発現させ、Western blottingで確認したところバンドを検出できませんでした。抗体はCSTのDYKDDDDK Tag (D6W5B) Rabbit mAbを使用し、室温で1.5時間反応させました。しかし、目的のタンパク質Aに対する抗体を用いて検出をしたところ、タンパク質Aのバンドは検出できました。 FLAG抗体で検出できなかった理由としてどのようなことが考えられますでしょうか。

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