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kozak sequenceはどうしてますか？ トピック削除
No.11470-TOPIC - 2023/05/29 (月) 14:08:48 - kozak
RT-PCRでとある遺伝子をクローニングし、レンチウイルスベクターに組み込みたいです。
下のようなプライマーでRT-PCRを行ったのですが、kozakが無い時はRTPCRが上手く行くのですが、kozakを入れると上手く行かなくなります。

Forward primer
ACCGCC(Kozak)-ATG----------

Reverse primer
Stop----------------

GCが多いので上手くかからないようなのですが、
ACCを削って、GCCのみでも発現するのかなと考えており、検討しています。

みなさんはどのようなkozak sequenceを発現プラスミドに挿入してますか？
GCCのみだと発現しない、などアドバイスがありましたら
ご教示いただけますと幸いです。
　
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No.11470-8 - 2023/06/06 (火) 02:12:01 - おお
ほかのすれで書きましたが、

＞Kozak配列に関しては昔詳しく知らないときにKozak配列なしでConstructionした時、しっかりとした発現が得られなかったことがあるので、ACC-ATGぐらいのミニマムのものはつけることにしています。

インビトロジェンやプロメガのテクニカルノートのようなところにそういう記述があります。

(無題) 削除/引用
No.11470-7 - 2023/06/05 (月) 19:23:57 - G25
余談

Kozak配列を最初に知った時、Kozakという名から勝手にスラヴ系のおっさんを想像していましたが、実はマリリンという名の女性でまだ40代のころに発表した仕事でした。

Kozak博士は孤軍奮闘、数多の論敵とやりあった末、ネガティブキャンペーンを受けて研究費を止められ、終には、まだ60歳かそこらのころに、サイエンスの世界から姿を消してしまって所在不明らしいですね。
そのせいか、Kozak 博士の翻訳開始の理論やKozak配列は負け組あつかいっぽいというか、軽視されがちであるように思います。

こういう話聞かされると判官贔屓しちゃうな
https://www.rnaj.org/en/?view=article&id=561:furuichi-8&catid=97
https://homolog.us/blogs/distraction/2015/11/10/first-human-bioinformatician-criticizes-bad-science-of-nih-funded-bigshots-disappears/

(無題) 解決済み 削除/引用
No.11470-6 - 2023/06/01 (木) 11:55:25 - kozak
みなさま

ご助言有難うございました。
RT-PCR一回のみでcDNAを検出したかったので
naitveのkozak or ACCのみでやってみたいと思います。

Kozak先生の話も面白かったです。有難うございます！

(無題) 削除/引用
No.11470-5 - 2023/05/31 (水) 00:09:00 - おお
たぶん最小のコンセンサスとして使われているのは、
ACCAUGG
最後のGはアミノ酸をコードしている部分なので目的のタンパクしだいですが、そんなに長くなくていいようですね。

(無題) 削除/引用
No.11470-4 - 2023/05/29 (月) 23:19:35 - SYBR master
>[Re:1] kozakさんは書きました :
> Forward primer
> ACCGCC(Kozak)-ATG----------

根源的な話ですが、そもそもKozakは有ると「発現が(場合によっては）多くなる」程度であって、絶対的なルールでは無いです。ぶっちゃけ、全然関係ない状態でも、first ATGから発現します。絶対的なルールでは無いので、提唱した本人の意思には関わらずですが、余り気にされて折らず、以前(30年くらい前かな)はそう扱われていました。なのでPCR等で無理にKozakをいれるくらいなら、nativeのATGの前後をいれておく方が、論文等では説明はしやすいと思いますよ。

国際学会とかでのやり取り見ましたが、個人的にはそこはテーマ的にどうでも良いのにもかかわらず、Dr. KozaKがエキサイトしていた記憶だけ有ります（たぶん分野が合えばＧ25さんが詳しいと思いますw）。

(無題) 削除/引用
No.11470-3 - 2023/05/29 (月) 15:45:34 - 長くしては
kozak+21塩基くらい入れれば大抵かかってます。

(無題) 削除/引用
No.11470-2 - 2023/05/29 (月) 14:31:25 - おお
コザックなしでPCRしてターゲットを濃縮してからコザック入りプライマーでPCRすれば？

kozak sequenceはどうしてますか？ 削除/引用
No.11470-1 - 2023/05/29 (月) 14:08:48 - kozak
RT-PCRでとある遺伝子をクローニングし、レンチウイルスベクターに組み込みたいです。
下のようなプライマーでRT-PCRを行ったのですが、kozakが無い時はRTPCRが上手く行くのですが、kozakを入れると上手く行かなくなります。

Forward primer
ACCGCC(Kozak)-ATG----------

Reverse primer
Stop----------------

GCが多いので上手くかからないようなのですが、
ACCを削って、GCCのみでも発現するのかなと考えており、検討しています。

みなさんはどのようなkozak sequenceを発現プラスミドに挿入してますか？
GCCのみだと発現しない、などアドバイスがありましたら
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